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21.1 : Anémie falciforme - Biologie

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Anémie falciforme : un regard sur le lien entre l'ADN et le phénotype

Les gènes sont traduits en protéines ; les mutations entraînent souvent (mais pas toujours) des changements dans la séquence des acides aminés dans ces protéines. Des changements dans la séquence d'acides aminés peuvent modifier (de diverses manières) voire détruire complètement la fonction des protéines. Les protéines ont de nombreuses fonctions au sein des cellules, et un changement dans ces fonctions entraîne un changement dans le phénotype de cette cellule ou de cet organisme. Ainsi, une mutation aussi simple qu'un simple changement de base dans une séquence d'ADN peut avoir des effets dramatiques sur le phénotype. L'un des meilleurs exemples de ce phénomène peut être observé lorsque des mutations se produisent dans le gène de l'un des composants protéiques de la protéine des globules rouges que nous appelons l'hémoglobine.

Une composante majeure de la érythrocytes (globules rouges) trouvés chez les vertébrés est hémoglobine. Une molécule d'hémoglobine d'un humain adulte normal contient quatre protéines (deux polypeptides alpha identiques et deux polypeptides bêta identiques) entourant un noyau d'hème (molécule complexe contenant un atome de fer qui peut se combiner de manière réversible avec l'oxygène). Ainsi, l'hémoglobine fonctionne comme le principal constituant du sang qui transporte l'oxygène. En raison de l'hémoglobine, un volume donné de sang peut transporter beaucoup plus d'oxygène que ce qui pourrait être dissous dans un volume égal d'eau.

Dans de nombreuses populations humaines, notamment celles d'origine centrafricaine ou méditerranéenne, il existe des individus qui souffrent d'anémie sévère et dont le sang contient de nombreux érythrocytes déformés en forme de faucille. Par conséquent, la maladie a reçu le nom d'anémie falciforme.

Figure 1. Remarquez les cellules en forme de faucille dans l'image du Dr Graham Beards via Wikimedia Commons

Des études biochimiques ont établi que le gène affecté dans l'anémie falciforme a le code d'un polypeptide bêta anormal, qui est l'un des composants de la molécule d'hémoglobine. Par conséquent, il existe deux formes différentes du gène de l'hémoglobine qui code pour la chaîne bêta :

  • Formulaire 1: HbUNE a le code d'une chaîne bêta normale
  • Formulaire 2 : HbS a le code d'une chaîne bêta anormale

Les humains sont diploïde organismes; ils ont deux copies de la plupart des gènes. Cependant, les deux exemplaires qu'ils possèdent ne doivent pas nécessairement être identiques. Lorsqu'il y a deux allèles possibles pour un gène (comme dans le gène de la chaîne bêta de l'hémoglobine), un individu diploïde aura l'une des trois combinaisons possibles des deux allèles. Ils peuvent être HbUNE HbUNE , HbUNE HbS, ou HbSHbS.

L'ensemble des allèles présents chez un individu pour un gène donné est appelé génotype. Les trois combinaisons de deux allèles ci-dessus sont donc les trois génotypes différents. Les individus qui ont deux copies du même allèle sont appelés homozygote; les individus avec deux allèles différents sont appelés hétérozygote. Donc un individu qui est HbUNE HbUNE est une chaîne bêta normale homozygote; un individu qui est HbUNE HbS est hétérozygote; et une personne qui est HbS HbS est une chaîne bêta anormale homozygote. C'est l'homozygote HbS les individus qui contiennent des cellules sanguines en forme de faucille.

Mécanisme de la maladie

Dans les capillaires (vaisseaux sanguins microscopiques qui échangent directement de l'oxygène avec les tissus), les érythrocytes peuvent être soumis à une faible tension d'oxygène après avoir perdu leur oxygène vers les tissus environnants. Dans cette situation de faible teneur en oxygène, les molécules d'hémoglobine anormales de HbS HbS les individus ont tendance à polymériser (s'unir), formant des fibres tubulaires rigides qui finissent par déformer la forme de l'érythrocyte entier, lui donnant la forme caractéristique de « faucille ». Ces cellules falciformes ont un certain nombre d'effets sur le corps via deux processus.

  1. Les cellules falciformes sont moins capables d'entrer et de se déplacer dans les capillaires : une fois dans les capillaires, elles obstruent le flux capillaire et provoquent de petits caillots sanguins. Une circulation sanguine réduite entraîne une diminution de la disponibilité de l'oxygène dans les tissus. Un apport réduit en oxygène entraîne la mort des tissus et des dommages aux organes vitaux (par exemple, le cœur, le foie et la rate).
  2. Les globules rouges falciformes ont une durée de vie plus courte que les globules rouges normaux : la durée de vie réduite des érythrocytes impose une plus grande demande à la moelle osseuse pour fabriquer de nouveaux globules rouges et à la rate pour décomposer les érythrocytes morts. Une demande accrue sur la moelle osseuse entraîne une douleur intense dans les os longs et les articulations. Les personnes atteintes de drépanocytose sont fréquemment malades et ont généralement une durée de vie considérablement réduite. Ces personnes seraient atteintes de drépanocytose.

Individus hétérozygotes (HbUNE HbS) sont dits transporteurs pour l'anémie falciforme. Notez qu'il s'agit d'un terme spécifique et que ce n'est pas la même chose que l'anémie falciforme - les hétérozygotes n'ont pas la maladie eux-mêmes, mais leurs enfants peuvent hériter de la maladie. Les porteurs n'ont pas d'anémie, sont en bonne santé (tout comme HbUNE HbUNE individus), et leurs érythrocytes conservent une forme normale dans le sang. En d'autres termes, ils sont phénotypiquement normaux dans la plupart des conditions, et ne savent probablement pas qu'ils « portent » le HbS allèle. Cependant, si les hétérozygotes sont exposés à des conditions de faibles niveaux d'oxygène (telles qu'une activité intense à haute altitude), certains de leurs érythrocytes sont falciformes. Les globules rouges dans des échantillons de sang d'hétérozygotes soumis à une tension d'oxygène fortement réduite en laboratoire sont également falciformes.

Pourquoi la drépanocytose est-elle la plus répandue chez les personnes d'origine centrafricaine et méditerranéenne ? Si vous regardez la figure 2, vous verrez que l'apparition de l'anémie falciforme se chevauche avec l'omniprésence du paludisme. Cela semble étrange, mais les individus hétérozygotes (HbUNE HbS) pour l'allèle drépanocytaire sont moins susceptibles de contracter et de mourir du paludisme que ceux qui sont homozygotes (HbUNE HbUNE). Les HbS le polypeptide qui est produit par l'individu hétérozygote arrête l'organisme (Plasmodium) qui provoque l'invasion des globules rouges par le paludisme. Ainsi, dans les zones où le paludisme est courant, il y a une pression de sélection pour le HbS allèle, et le HbS allèle se produit à une fréquence plus élevée parce que ceux qui ont une copie du HbS allèle vivra plus longtemps et aura plus d'enfants. Dans les zones où le paludisme n'est pas courant, il y a une pression de sélection contre le HbS allèle, et le HbS allèle se produit dans une fréquence inférieure. Comme vous l'apprendrez dans un chapitre ultérieur, il y a 25 % de chances que deux porteurs aient un enfant homozygote HbS HbS), et cet enfant paiera le prix de l'évolution de la protection contre le paludisme dont les parents ont bénéficié. Il semble que ce soit de cette manière que l'évolution par sélection naturelle conserve un tel allèle potentiellement néfaste dans une population. L'exemple de la drépanocytose n'est qu'un de ce qu'on appelle l'avantage hétérozygote ; nous avons fourni un certain nombre d'autres exemples dans le tableau 1.

Figure 2. La ligne hachurée représente la répartition du paludisme. Les différentes couleurs rouges représentent la fréquence relative de l'allèle drépanocytaire dans la population, le rouge foncé ayant la fréquence la plus élevée et le rouge clair ayant la fréquence la plus faible. uvre d'Eva Horne.

Tableau 1. Exemples d'avantage hétérozygote chez l'homme

Distribution du paludisme et fréquence de l'allèle drépanocytaire

Maladie récessiveAvantage hétérozygoteExplication possible
Fibrose kystiqueProtection contre les maladies diarrhéiques telles que le choléraLes porteurs ont trop peu de canaux chlorure fonctionnels dans les cellules intestinales, bloquant la toxine
Déficit en G6PDProtection contre le paludismeGlobules rouges inhospitaliers au paludisme
Phénylcétonurie (PCU)Protection contre les fausses couches induites par une toxine fongiqueL'excès d'acide aminé (phénylalanine) dans les porteurs inactive la toxine
La maladie de Tay-SachsProtection contre la tuberculoseInconnu
Diabète sucré non insulinodépendantProtection contre la famineLa tendance à prendre du poids protège contre la famine pendant la famine

Les tests ELISA pratiques sont un excellent moyen de rendre la biologie moléculaire pertinente pour vos étudiants.

Deux des plus grandes épidémies des 40 dernières années, des épidémies que tous vos élèves connaîtront, ont été le virus de l'immunodéficience humaine qui cause le SIDA et le SRAS-CoVirus 2, plus communément appelé COVID-19. Le test ELISA d'acides aminés s'est avéré tout aussi utile pour le dépistage du COVID-19 qu'il l'était pour le dépistage du VIH il y a 40 ans.

Vos élèves pourraient également être intéressés de savoir que ELISA a été adapté pour les tests de grossesse à domicile. En clinique, il est utilisé pour tester le cancer de la prostate et les anticorps générés dans le lupus, la polyarthrite rhumatoïde et d'autres maladies auto-immunes qu'ils rencontreront plus loin dans leurs études.
Les étudiants sauront à quoi sert ELISA, même s'ils ne peuvent pas expliquer quelle est la technique, comme dans cet exemple de réponse à la question de l'étude, « Qu'est-ce que ELISA ?

ELISA est une méthode puissante pour détecter des protéines spécifiques dans des mélanges de protéines complexes. Il continue d'être de plus en plus utilisé en médecine pour détecter les anticorps produits en réponse à la présence d'agents pathogènes comme ceux produits par le VIH et le nouveau coronavirus. Au cours des derniers mois de 2020, les progrès des tests ELISA ont rendu possible un "test de crachat" pour COVID-19. Un test immuno-enzymatique à base de sérum disponible dans le commerce a rendu possible le dépistage rapide du virus avec une spécificité de 100 %, à peu près dans la même veine que les tests ELISA rapides pour le VIH qui existent depuis plusieurs années.
Les enseignants peuvent motiver leurs élèves à faire attention avec ELISA. Et les étapes pour effectuer le test immunologique ELISA de Modern Biology IND-03 ne pourraient pas être plus simples. Dans cette expérience, les élèves utilisent une procédure éprouvée pour lier un antigène aux parois de la microplaque, lier un anticorps lié à une enzyme à l'antigène, puis utiliser cette enzyme pour détecter la présence de l'antigène, indiquant une infection.
Les tests de réaction en chaîne par polymérase (PCR) ont également été utilisés comme méthode de détection du COVID. L'amplification de l'ARN viral permet de voir beaucoup plus facilement les petites quantités d'ADN requises pour les tests. La PCR et l'ELISA sont des tests rapides que vos étudiants peuvent effectuer rapidement, au cours d'une période de laboratoire typique. Plus tard dans votre cours, vos étudiants peuvent travailler avec le matériel de laboratoire fourni par IND-07 : Amplification d'un gène d'hémoglobine par PCR pour amplifier quelques nanogrammes d'ADN en quelques milligrammes d'ADN en quelques heures, puis IIND-21 : Identification de séquences d'ADN génomique et plasmidique dans E. coli par PCR sur colonie pour amplifier des séquences d'ADN spécifiques sans purification d'ADN.

Étapes de cette expérience
Il est utile d'expliquer aux étudiants que l'ELISA direct dans les laboratoires médicaux est généralement effectué dans une plaque de microtitration à 96 puits par une réaction chimique qui entraîne la fixation covalente de l'antigène, qui est le plus souvent une protéine, par l'intermédiaire de ses groupes aminés libres. Le test implique ensuite de sonder chaque puits revêtu avec un anticorps spécifique de l'antigène cible, de sonder cet anticorps lié avec un second anticorps spécifique de la région stable du premier anticorps et d'utiliser diverses méthodes de détection. Différentes enzymes entraînent des changements de couleur différents qui peuvent être lus automatiquement avec un scanner dans certains paramètres de laboratoire, ou dans le cas de cette expérience, peuvent être vus à l'œil nu.
Qu'implique l'enseignement de ces laboratoires ? Considérons les étapes faciles pour enseigner la biologie moderne IND-03 : dosage immunologique ELISA.

  1. Dans ce laboratoire, vos étudiants utiliseront un anticorps IgG de chèvre anti-lapin pour étudier la spécificité d'une réaction anticorps-antigène, afin de comparer la liaison de ce sérum d'anticorps aux IgG dans le sérum de poulet, de vache, de cheval et de lapin . Pour aider à cela, l'IgG anti-lapin a été liée de manière covalente à la peroxydase, qui catalysera une réaction de production de couleur, afin que vos élèves puissent étudier les résultats sans l'aide d'un équipement spécialisé.
  2. Demandez à vos élèves de travailler en binôme. Le kit ELISA Immunoassay comprendra les réactifs et le matériel de test nécessaires pour que l'expérience soit réalisée deux fois par 8 groupes, ou une fois par 16 groupes d'étudiants. Assurez-vous que chaque groupe a lu le guide inclus avec vos fournitures avant de commencer le laboratoire et a tout le matériel inclus, comme indiqué dans le guide d'expérience.
  3. Vos groupes d'étudiants devront numéroter la plaque de microtitration fournie. Ces plaques sont généralement d'une taille pour accueillir 96 puits sur leur surface, mais pour les besoins de cette expérience, elles seront fournies avec une section 1/4 d'une plaque standard, ce qui donne une plaque qui contient 24 puits. Ces plaques doivent être étiquetées de manière à ce qu'en haut de la grille lisent les chiffres de un à six, et sur le côté gauche se trouvent les lettres A à D pour un suivi clair des expériences.
  4. Ensuite, ils devront procéder à l'absorption de l'antigène, ce qui obligera les étudiants à effectuer des dilutions en série de dix fois des sérums, après quoi la plaque devra être laissée au repos pendant vingt minutes pour laisser suffisamment de temps aux protéines. être adsorbé sur les surfaces du puits. Ensuite, vos élèves utiliseront de la gélatine TBS pour bloquer les sites sur le plastique qui ne sont pas liés aux protéines sériques. Une fois ce processus terminé, ils utiliseront des pipettes pour éliminer soigneusement les liquides dans chaque puits, les préparant à la réaction des anticorps.
  5. À partir de là, vos élèves ajouteront la peroxydase IgG anti-lapin de chèvre dans chaque puits et feront tourner la plaque pour s'assurer que toutes les surfaces au fond de chaque puits entrent en contact approprié avec la solution d'anticorps. La plaque devra à nouveau être laissée seule pendant 20 minutes, afin que l'anticorps puisse se lier correctement à l'IgG immobilisé. Après cela, la gélatine TBS sera à nouveau utilisée et l'excès de solution éliminé comme précédemment.
  6. La dernière étape pour vos élèves sera d'utiliser la solution de développement de couleur fournie dans chaque puits, puis d'attendre 15 minutes pour que le changement se produise. Après cela, la plaque de microtitration peut être placée sur un morceau de papier blanc afin que l'intensité du produit bleu et jaune puisse être examinée et comparée.
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[Analyse des hospitalisations des patients adultes drépanocytaires en Guadeloupe]

But: Déterminer les caractéristiques des hospitalisations aiguës chez le patient adulte drépanocytaire en Guadeloupe.

Méthodes : Nous avons étudié rétrospectivement les caractéristiques cliniques de patients adultes suivis par le Centre Caraïbe de la Drépanocytose (CCD) en 1996. Les données ont été recueillies à partir des dossiers médicaux des patients hospitalisés et des dossiers longitudinaux du CCD.

Résultats: Soixante-trois (25 %) des 251 patients suivis par le CCD ont nécessité une hospitalisation dans 87 cas (1,38 hospitalisation/patient). L'âge moyen des patients hospitalisés était de 27,5 ans (extrêmes 17 à 71 ans). La plupart des hospitalisations concernaient des hommes (29 [31 %] vs 34 [22 %] pour les femmes, P < 0,05), et la plupart concernaient des patients homozygotes atteints d'anémie falciforme : 39 (31 %) SS, 19 (18,55 %) SC et cinq (21,75 %) S bêta thal. Une crise vaso-occlusive douloureuse a été notée dans 67 épisodes. Il y a eu neuf syndromes thoraciques aigus (SCA), six d'entre eux sont survenus à la suite d'une crise vaso-occlusive. Nous avons noté 39 épisodes infectieux. L'augmentation de la protéine C-réactive (> 100 mg/L) était associée à un SCA ou à une infection urinaire. Un patient atteint d'insuffisance rénale est décédé au cours d'une septicémie.

Conclusion: Cette étude confirme la nécessité de prévenir les crises douloureuses et autres complications sévères chez les patients drépanocytaires.


Où l'acupuncture est-elle utilisée?

  • L'acupuncture est une modalité clinique fréquemment proposée aux patients souffrant de douleur.
  • L'acupuncture est incluse dans la médecine traditionnelle chinoise (MTC) et la médecine orientale traditionnelle coréenne (KTOM). Il fait partie intégrante des soins de santé non seulement en Chine et en Corée, mais au Japon, au Vietnam et dans d'autres régions d'Asie.
  • Depuis les années 1970, l'acupuncture est une profession autorisée aux États-Unis. Les médecins et autres professionnels peuvent également pratiquer l'acupuncture.

Hémolyse intravasculaire et physiopathologie de la drépanocytose

2 Division d'hématologie et d'oncologie, École de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis.

3 Département de médecine, Faculté de médecine de l'Université de Boston, Boston, Massachusetts, États-Unis.

4 Division de médecine pulmonaire, allergique et de soins intensifs, faculté de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis.

Adressez la correspondance à : Mark T. Gladwin, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 1218 Scaife Hall, 3550 Terrace Street, Pittsburgh, Pennsylvanie 15261, États-Unis. Téléphone : 412.648.3181 Courriel : [email protected]

1 Pittsburgh Heart, Lung and Blood Vascular Medicine Institute et

2 Division d'hématologie et d'oncologie, École de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis.

3 Département de médecine, Faculté de médecine de l'Université de Boston, Boston, Massachusetts, États-Unis.

4 Division de médecine pulmonaire, allergique et de soins intensifs, faculté de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis.

Adressez la correspondance à : Mark T. Gladwin, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 1218 Scaife Hall, 3550 Terrace Street, Pittsburgh, Pennsylvanie 15261, États-Unis. Téléphone : 412.648.3181 Courriel : [email protected]

Trouvez des articles de Steinberg, M. dans : JCI | PubMed | Google Scholar

1 Pittsburgh Heart, Lung and Blood Vascular Medicine Institute et

2 Division d'hématologie et d'oncologie, École de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis.

3 Département de médecine, École de médecine de l'Université de Boston, Boston, Massachusetts, États-Unis.

4 Division de médecine pulmonaire, allergique et de soins intensifs, faculté de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis.

Adressez la correspondance à : Mark T. Gladwin, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 1218 Scaife Hall, 3550 Terrace Street, Pittsburgh, Pennsylvanie 15261, États-Unis. Téléphone : 412.648.3181 Courriel : [email protected]

Trouvez des articles de Gladwin, M. dans : JCI | PubMed | Google Scholar

L'hémolyse est une caractéristique fondamentale de l'anémie falciforme qui contribue à sa physiopathologie et à sa variabilité phénotypique. L'hémoglobine décloisonnée, l'arginase 1, la diméthylarginine asymétrique et les nucléotides d'adénine sont tous des produits de l'hémolyse qui favorisent un dysfonctionnement vasomoteur, une vasculopathie proliférative et une multitude de complications cliniques de la vasculopathie pulmonaire et systémique, notamment l'hypertension pulmonaire, les ulcères de jambe, le priapisme, l'insuffisance rénale chronique, et un accident vasculaire cérébral ischémique des grosses artères. L'oxyde nitrique (NO) est inactivé par l'hémoglobine acellulaire lors d'une réaction de dioxygénation qui oxyde également l'hémoglobine en méthémoglobine, une forme d'hémoglobine ne liant pas l'oxygène qui perd facilement l'hème. L'hémoglobine circulante et l'hème représentent des molécules de schéma moléculaire associé au danger érythrocytaire (eDAMP), qui activent le système immunitaire inné et l'endothélium à un état inflammatoire et proadhésif qui favorise la vaso-occlusion de la drépanocytose et les lésions pulmonaires aiguës dans les modèles murins de drépanocytose. L'hémolyse intravasculaire peut altérer la biodisponibilité du NO et provoquer un stress oxydatif, altérant l'équilibre redox et amplifiant les processus physiologiques qui régissent le flux sanguin, l'hémostase, l'inflammation et l'angiogenèse. Ces réponses pathologiques favorisent la vasoconstriction régionale et le remodelage ultérieur des vaisseaux sanguins. Ainsi, l'hémolyse intravasculaire représente un mécanisme intrinsèque pour la maladie vasculaire humaine qui manifeste des complications cliniques dans la drépanocytose et d'autres anémies hémolytiques chroniques héréditaires ou acquises.

Les patients atteints d'hémoglobinopathies falciformes ont des phénotypes variables, avec des fréquences et des sévérités différentes de la douleur et des complications pléiotropes, notamment une lésion pulmonaire, un accident vasculaire cérébral, une ulcération cutanée de la jambe, une lésion rénale avec protéinurie, une ostéonécrose et une hypertension systémique et pulmonaire (PH). Ces phénotypes résultent d'une lésion érythrocytaire causée par l'hémoglobine falciforme (HbS) et sa polymérisation induite par la désoxygénation. Les lésions érythrocytaires entraînent une hémolyse extra- et intravasculaire, une dysfonction endothéliale et une vasculopathie, ainsi qu'une occlusion des petits et gros vaisseaux sanguins, produisant une ischémie/une lésion de reperfusion tissulaire et une inflammation. Les dommages aux érythrocytes circulants se produisent avec une grande diversité parmi les individus (1). Cette hétérogénéité résulte de différences dans les caractéristiques intrinsèques des érythrocytes drépanocytaires, comme la distribution hétérocellulaire de l'hémoglobine fœtale (HbF), la concentration en HbS ( 2 ), l'hydratation et la densité (3 , 4 ), et les transitions environnementales de la cellule de la macro-circulation à la microcirculation, laminaire à écoulement turbulent, normoxie à hypoxie, environnement isotonique à hypertonique et milieu acidotique à alcalotique. De multiples composants contribuent à la physiopathologie de l'hémoglobinopathie falciforme, y compris les composants primaires résultant de la polymérisation de l'HbS et les composants secondaires qui sont des effets en aval du polymère HbS. Comprendre comment la complexité de ces composants est aggravée par la modulation génétique et environnementale permet de mieux comprendre l'hétérogénéité clinique bien connue de la drépanocytose (SCD).

Une caractéristique cardinale de la pathogenèse de la SCD implique une inflammation, accompagnée d'événements adhésifs hétérocellulaires leucocytes-plaquettes-érythrocytes-endothéliaux qui déclenchent des épisodes vaso-occlusifs, une ischémie aiguë des organes et des lésions de reperfusion. Il y a vingt-cinq ans, des études épidémiologiques ont identifié la leucocytose, des taux d'HbF plus faibles et des taux d'hémoglobine totale plus élevés comme facteurs de risque associés à une incidence croissante d'épisodes douloureux aigus et de syndrome thoracique aigu (SCA) (5). L'association indépendante de taux élevés d'hémoglobine totale avec plus de douleur, d'événements de SCA et d'ostéonécrose n'a jamais été expliquée mécaniquement, cependant, elle était supposée être le résultat d'une augmentation de la viscosité du sang (tableau 1). Des études épidémiologiques récentes ont révélé que des taux d'hémoglobine plus faibles et une intensité plus élevée d'anémie hémolytique à l'état d'équilibre sont systématiquement associés à des complications vasculopathiques de la maladie, telles que les accidents vasculaires cérébraux, les ulcères de jambe, l'HTP, le priapisme et l'insuffisance rénale. Cela suggère que certains sous-phénotypes de la drépanocytose sont davantage liés à la gravité de l'anémie hémolytique qu'à la vaso-occlusion falciforme. Le lecteur est renvoyé à des revues récentes décrivant les progrès exceptionnels réalisés dans la compréhension des rôles de la rigidité des globules rouges (6), de l'inflammation et de l'adhésion cellulaire dans la vaso-occlusion falciforme (7 - 9). Ici, nous passons en revue le rôle complémentaire de l'hémolyse intravasculaire et de l'anémie. Sauf indication contraire, dans cette revue, « hémolyse » et « hémolyse intravasculaire » sont utilisés de manière interchangeable.

Sous-phénotypes de SCD et leur association avec l'hyperhémolyse, la -thalassémie et l'HbF

Neuf ans se sont écoulés depuis que nous avons proposé que la destruction intravasculaire des érythrocytes drépanocytaires soit liée d'un point de vue pathogénique à certaines complications courantes de la SCD, déclenchant un débat de longue haleine sur la base mécanistique de ces associations (10 – 12). Le nœud de l'hypothèse était une appréciation générale que les produits de l'hémolyse intravasculaire endommagent le système vasculaire (13). Plus précisément, il a proposé que l'épuisement de l'oxyde nitrique (NO) dans la microcirculation résultait de la libération d'hémoglobine acellulaire induite par l'hémolyse intravasculaire dans le plasma qui réagissait avec le NO via la réaction de dioxygénation bien connue pour former du nitrate inerte. Cette réaction se produit in vitro (14) et est favorisée par les substituts sanguins in vivo (15), et son apparition dans la SCD est étayée par des preuves in vitro et in vivo, résumées plus loin dans cette revue (16). Le NO est un radical libre produit par voie enzymatique par une famille de NO synthases (NOS) lors de la conversion de l'arginine en citrulline. Le NO endothélial, produit par la NOS3 endothéliale, diffuse vers le muscle lisse adjacent, où il se lie et active l'hème de la guanylate cyclase soluble, qui convertit ensuite le GTP en cGMP. Cette activation des protéines kinases dépendantes du GMPc produit une vasodilatation en provoquant la séquestration du calcium et la relaxation des muscles lisses périvasculaires. Le NO est également épuisé lors de l'hémolyse intravasculaire lorsque l'arginase est libérée des érythrocytes, détruisant l'arginine, le substrat de la NOS (17), et par les réactions du NO avec les ROS générées lors de l'hémolyse intravasculaire. En aggravant les effets de ces voies de piégeage du NO et de l'arginine, les globules rouges lysés libèrent de la diméthylarginine asymétrique, un inhibiteur endogène de la NOS (18). Le rôle de l'hémolyse intravasculaire dans la promotion de la dysfonction endothéliale a été renforcé par des études de cohorte épidémiologiques reliant les biomarqueurs de laboratoire de l'intensité de l'anémie hémolytique et le risque de développer des complications spécifiques de la drépanocytose, notamment l'HTP (19), l'ulcération cutanée de la jambe (20, 21), le priapisme ( 22), accident vasculaire cérébral ( 23 ) et, récemment, protéinurie et insuffisance rénale ( 24 - 26 ). En revanche, comme mentionné précédemment, d'autres complications étaient associées à des taux d'hémolyse plus faibles et à des taux d'hémoglobine à l'état d'équilibre plus élevés, notamment le taux d'épisodes douloureux vaso-occlusifs, de SCA et d'ostéonécrose (tableau 1). Contrairement à l'hémolyse, les facteurs de risque traditionnels établis pour les épisodes vaso-occlusifs, tels que la leucocytose à l'état d'équilibre (27, 28) et les taux élevés d'hémoglobine (29), ne permettent pas de prédire avec précision les événements vasculopathiques mentionnés ci-dessus et la mortalité observée à mesure que la population de patients vieillit. . À ce jour, aucun mécanisme alternatif n'a été proposé pour expliquer les associations divergentes entre la sévérité de l'anémie hémolytique et des complications cliniques spécifiques.

Avec une décennie de nouvelles données à examiner, nous réévaluons maintenant la relation entre l'hémolyse intravasculaire et la physiopathologie de la SCD et étendons davantage le rôle de l'hémolyse intravasculaire et du piégeage du NO à d'autres maladies.

Les phénotypes SCD sont exprimés dans des sous-phénotypes communs et rares. Certains sous-phénotypes sont attribués à des événements vaso-occlusifs falciformes déclenchés par des érythrocytes falciformes adhérents et sont étroitement liés à l'hématocrite, à la viscosité du sang et à l'inflammation/adhérence intracellulaire. D'autres événements sont une conséquence présumée de l'hémolyse intravasculaire des cellules drépanocytaires lésées. Le tableau 1 répertorie les sous-phénotypes courants de la maladie et leurs associations épidémiologiques avec les biomarqueurs de l'anémie hémolytique et de l'inflammation/viscosité/vaso-occlusion. L'HbF et la -thalassémie sont les deux principaux modulateurs du phénotype SCD. L'HbF a ses effets les plus robustes sur les sous-phénotypes associés à la vaso-occlusion falciforme, y compris le SCA (30 à 32). L'incapacité de l'HbF à offrir des niveaux de protection similaires pour les sous-phénotypes associés à l'hémolyse pourrait être une conséquence d'une HbF insuffisante dans certaines cellules, ce qui permet une hémolyse intravasculaire continue et des lésions endothéliales sur de longues expositions (33, 34).

La -thalassémie module le phénotype de la SCD en réduisant l'hémolyse (35). La -thalassémie réduit la concentration moyenne d'hémoglobine cellulaire et la densité érythrocytaire, réduisant ainsi la tendance de la désoxy-HbS à se polymériser (35). Chez les hétérozygotes composés pour la -thalassémie et l'anémie falciforme (SCA, caractérisée par une homozygotie pour le gène HbS), les taux d'hémoglobine sont plus élevés et la prévalence des sous-phénotypes associés à l'anémie hémolytique est réduite par rapport au SCA seul contrairement au SCA, la prévalence de crise de douleur vaso-occlusive et la prévalence du SCA sont augmentées (36). Conformément à cette observation, dans un essai clinique contrôlé par placebo chez des adultes atteints d'ACS, un inhibiteur du canal Gardos a significativement réduit l'hémolyse, augmenté les taux d'hémoglobine et augmenté le taux d'épisodes douloureux vaso-occlusifs (37). La réduction de l'hémolyse par l'inhibiteur du canal Gardos a été associée à une diminution significative du peptide natriurétique de type N-terminal pro-B (NT-proBNP) (38), potentiellement compatible avec une diminution de la pression artérielle pulmonaire, mais aussi peut-être simplement causée par une anémie améliorée. et une précharge cardiaque inférieure (39). Les résultats de cette intervention pharmacologique antihémolytique phénocopient substantiellement la SCA-α-thalassémie, soutenant davantage la modulation phénotypique de la SCD par l'hémolyse et l'anémie. Outre l'augmentation de la viscosité du sang, seule une adhérence accrue est supposée médier le risque accru de vaso-occlusion dans l'ACS-α-thalassémie (40), mais aucune preuve publiée ne soutient cette hypothèse alternative.

De nombreuses études ont confirmé l'association de marqueurs indirects de l'hémolyse avec certaines complications de la maladie. Le taux d'hémolyse dans la SCD a été mesuré directement par des études de survie des érythrocytes marqués (34, 41). Plus souvent, des substituts indirects de la durée de vie des globules rouges, y compris l'hémoglobine plasmatique, l'hémoglobine totale, les microparticules érythrocytaires, la bilirubine sérique, le nombre de réticulocytes, la lactate déshydrogénase (LDH), l'alanine aminotransférase (AST) et l'hémosidérine urinaire ou l'hémoglobine acellulaire, ont été utilisés seuls et en combinaison pour estimer l'intensité de l'hémolyse (20, 25). Les indices composites caractérisant la gravité de l'hémolyse ont été validés par comparaison avec les taux plasmatiques d'hémoglobine acellulaire et de microparticules de globules rouges. Ces mesures sont corrélées de manière appropriée avec le nombre d'hémoglobine et de réticulocytes et sont diminuées chez les patients présentant une HbF élevée ou une α-thalassémie (25). Sur la base des mesures d'hémoglobine plasmatique, la fraction d'hémolyse intravasculaire varie de moins de 10 % à plus de 30 %, tandis que les concentrations plasmatiques totales d'hémoglobine (rapportées ici en termes de concentration d'hème) varient de 0,25 à plus de 20 M (16). Comme discuté plus tard, ces concentrations sont suffisantes pour piéger le NO et peut-être déclencher une vasculopathie falciforme.

Un paradigme suggéré propose un gradient d'hémolyse chez les patients atteints de drépanocytose, le quartile le plus élevé de ce gradient étant parfois appelé hyperhémolyse (19 – 23, 25, 26, 41, 42 – 47). Ce gradient résulte de la distribution différentielle des concentrations d'HbF parmi les érythrocytes falciformes, de la présence ou de l'absence de mutations de la -thalassémie et peut-être d'autres déterminants génétiques qui affectent directement ou indirectement la durée de vie des érythrocytes (36). L'HTP, les maladies cérébrovasculaires, les ulcères de jambe, le priapisme et la néphropathie falciforme font partie des sous-phénotypes vasculopathiques associés à l'hyperhémolyse. La vitesse de régurgitation tricuspide (VRT) et le NT-proBNP sérique sont des marqueurs de la maladie vasculaire pulmonaire et du stress de la paroi myocardique et sont systématiquement associés à l'hyperhémolyse (19, 39, 44, 48-56). L'HTP, soit dépistée avec la VTR, soit définitivement déterminée par cathétérisme cardiaque droit, est étroitement associée à l'intensité de l'hémolyse et de la mortalité (discutée ci-dessous). Certains aspects du phénotype hémolytique, comme une VTR et un pH anormalement élevés confirmés par un cathétérisme cardiaque droit, sont observés dans d'autres anémies hémolytiques où l'hémolyse intravasculaire est courante (et la crise vaso-occlusive est absente) comme la β-thalassémie (57). De manière similaire à la SCD (58), ces autres troubles hémolytiques présentent également un état d'hypercoagulabilité avec des signes de maladie microthrombotique dans le système vasculaire pulmonaire (59).

De nombreuses études de cohorte ont évalué et confirmé l'association entre la sévérité de l'anémie hémolytique et l'augmentation des pressions pulmonaires estimées par la VTR et directement mesurées par cathétérisme cardiaque droit. Bon nombre de ces études ont également évalué la relation entre les pressions artérielles pulmonaires estimées ou directement mesurées et la capacité d'exercice réduite et/ou le risque de décès. Ces études comprennent les cohortes NIH-PH (19), Duke (60), UNC (49), MSH (39), CSSCD (54), PUSH (50, 61) et Walk-PHASST (51), une cohorte grecque ( 62 ) et une récente étude de dépistage échocardiographique de 656 patients atteints de SCD à Créteil, en France ( 63 ). L'analyse de plus de 600 patients de dépistage dans les cohortes Walk-PHASST et Créteil a trouvé des associations similaires entre les indices d'anémie hémolytique, une VTR élevée et le risque de décès (51, 63). Ces associations ont été largement confirmées dans les études de cathétérisme cardiaque droit (64-66).

La gravité de l'anémie hémolytique était associée non seulement au risque d'HTP précapillaire, mais aussi au risque d'HTP postcapillaire. Ce dernier a été observé avec des marqueurs échocardiographiques d'insuffisance cardiaque avec fraction d'éjection préservée (67 – 70) et cathétérisme cardiaque droit (64 – 66). L'implication de la maladie ventriculaire gauche complique le diagnostic, la gestion clinique et le pronostic de la drépanocytose, comme discuté ci-dessous.

Alors que l'anémie hémolytique est un facteur de risque indépendant de complications vasculopathiques, l'hémolyse ne se produit pas isolément. Le priapisme et les ulcères de jambe surviennent plus fréquemment chez les patients atteints de drépanocytose que chez les patients atteints d'autres maladies hémolytiques comme l'hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN), la sphérocytose, la -thalassémie et le déficit en pyruvate kinase, ce qui représente sûrement la contribution des caractéristiques uniques de la drépanocytose, de la drépanocytose. vaso-occlusion et dommages inflammatoires aux lésions provoquées par l'hémolyse intravasculaire. Cela est particulièrement évident dans l'épidémiologie du priapisme, dans laquelle des indices d'anémie hémolytique et d'inflammation sont associés à cette manifestation clinique (71). Un lien entre l'hémolyse et la vaso-occlusion falciforme pourrait résider dans l'adhérence accrue du réticulocyte falciforme, la lyse des érythrocytes falciformes dans les régions vaso-occluses (discutées ci-dessous) et les effets inflammatoires en aval des produits d'hémolyse intravasculaire, comme l'hème, qui entraînent une inflammation stérile.

La VTR peut être quantifiée par échocardiographie Doppler et utilisée pour estimer la pression systolique de l'artère pulmonaire. Cette valeur est un biomarqueur physiologique prédictif et un test de dépistage largement utilisé pour l'HTP. Bien que la VTR présente des limites importantes en termes de sensibilité et de spécificité, il s'agit d'une variable continue inversement proportionnelle à la capacité d'exercice mesurée par la distance de marche de 6 minutes et directement liée à l'augmentation du risque de décès chez les adultes atteints de drépanocytose (19, 49, 51, 60 , 63 , 72 ). Cependant, la prise de décision clinique exige des classifications catégorielles largement utilisées. VTR = 2,5 m/s représente 2 SD au-dessus de la moyenne de la population VTR 3 m/s est 3 SD au-dessus de la moyenne. Les patients atteints de drépanocytose avec une VTR 2,5 m/s ont une capacité d'exercice et un temps de survie inférieurs (Figure 1). Par exemple, dans l'étude de Créteil, la probabilité de décès était faible chez les patients atteints de drépanocytose avec une VTR 2,5 m/s, alors qu'une VTR 2,5 m/s était associée à un hazard ratio de 6,81 en analyse multivariée et augmentait linéairement au-dessus de cette valeur. avec une probabilité de décès de 50 % à VTR = 3,2 m/s ( 63 ). Ces résultats sont cohérents avec d'autres grandes études de cohorte (19, 51, 63, 72), car les résultats de la cohorte NIH-PH et de la cohorte de Paris suggèrent qu'environ 64 % à 75 % des patients atteints de drépanocytose avec une VTR 3 m/s ont un PH défini par la documentation de cathétérisme de l'artère pulmonaire d'une pression artérielle pulmonaire moyenne supérieure à 25 mmHg, environ 3 SD au-dessus de la valeur moyenne normale (64, 65). Les patients atteints de drépanocytose qui tombent dans la catégorie intermédiaire de VTR = 2,5 à 2,9 m/s (entre 2 et 3 SD de la moyenne) ont une capacité d'exercice et une mortalité intermédiaires, se situant carrément entre le groupe VTR 2,5 m/s et le groupe VTR ≥ 3 groupe m/s. Les études de cathétérisme ont indiqué qu'environ 25 % de ces patients ont une pression artérielle pulmonaire moyenne supérieure à 25 mmHg, ce qui confirme la valeur prédictive faible mais significative d'une VTR intermédiaire pour identifier les patients à risque d'HTP (65). Ainsi, la catégorie VTR est prédictive du risque d'HTP et de mortalité. Une VTR 2,5 m/s prédit également un risque plus élevé d'ulcères de jambe (46, 60), de thrombose (58), de protéinurie (60, 73) et d'intolérance à l'exercice (74, 75), suggérant qu'elle sert également de marqueur pour vasculopathie plus générale.

La vitesse de régurgitation tricuspide à l'échocardiogramme est un biomarqueur physiologique qui prédit la survie et les résultats fonctionnels. La vitesse de régurgitation tricuspide (VTR) inférieure de moins de deux ET à la moyenne de la population se situe dans la plage normale (<2,5 m/s), est associée à des pressions systoliques artérielles pulmonaires calculées normales (PASP, <25 mmHg) et correspond généralement à une pression artérielle pulmonaire moyenne (MPAP, <20 mmHg), une bonne survie à long terme et une bonne tolérance à l'exercice, comme indiqué par une distance de marche plus élevée de 6 minutes (>400 m). À l'inverse, une VTR très élevée supérieure de plus de 3 ET à la moyenne (≥ 3 m/s) est fortement associée à une faible tolérance à l'exercice avec une distance de marche inférieure à 6 minutes (<400 m), une pression systolique de l'artère pulmonaire supérieure à 40 mmHg, moyenne une pression artérielle pulmonaire supérieure à 25 mmHg lors d'un cathétérisme cardiaque droit et une survie à long terme significativement plus faible. Le niveau intermédiaire de VTR (2,5 à 2,9 m/s) est associé à un risque intermédiaire d'intolérance à l'exercice et de mortalité. La figure est adaptée avec l'autorisation du Journal de l'Association médicale américaine ( 39 ) et le American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine ( 74 ).

La méta-analyse a aidé à trier les nombreuses études différentes sur la prévalence et le risque de VTR élevée dans la drépanocytose. Cette méta-analyse comprenait 45 études de 15 pays et 6 109 patients (47). La prévalence d'une VTR élevée ≥ 2,5 m/s était de 21 % chez les enfants et de 30 % chez les adultes. Dans les méta-analyses à effets aléatoires, la marche de 6 minutes était de 30,4 m de moins chez les patients avec une VTR élevée que chez ceux sans VRT élevée, et le rapport de risque de mortalité associé était de 4,9. La mortalité chez les patients atteints de drépanocytose à VTR élevée semble être limitée aux adultes, ce qui suggère l'hypothèse vérifiable qu'une VTR élevée dans l'enfance prédit le risque futur de mortalité plus tard à l'âge adulte. Les estimations de la mortalité deviennent probablement plus précises à mesure que le nombre d'adultes dépistés et la durée du suivi augmentent.

En général, un cathétérisme cardiaque droit est nécessaire pour un diagnostic définitif d'HTP, qui est défini par une pression artérielle pulmonaire moyenne d'au moins 25 mmHg, bien qu'il soit de plus en plus reconnu que les pressions moyennes entre 20 et 25 mmHg ne sont pas normales et pourraient prédire une diminution capacité d'exercice et risque. Trois études hémodynamiques de la SCD, aux États-Unis, au Brésil et en France, ont évalué la prévalence de l'HTP définie par le cathétérisme cardiaque droit dans la SCD et ont examiné les facteurs de risque cliniques associés et le risque potentiel de décès. Dans l'étude avec les temps de suivi les plus longs, réalisée au NIH, 531 patients atteints de drépanocytose ont été évalués avec un temps de suivi médian de 4,7 ans et un maximum de 11 ans pour les sujets survivants (64, 76). Dans cette cohorte, 84 cathétérismes cardiaques droits ont été effectués. Fifty-five of 531 SCD subjects (10.4%), or 55 of 84 (65.5%) of those who underwent catheterization, had PH slightly more than half had pulmonary arterial hypertension (precapillary), and the other half had pulmonary venous hypertension. PH was associated with higher LDH levels and lower hemoglobin levels, higher prevalence of leg ulcers and renal insufficiency, and lower exercise capacity, defined by worse functional classification and lower 6-minute walk distance ( 64 , 76 ).

Survival estimates for SCD patients with PH was 63% at 5 years, compared with 83% for SCD patients with normal right heart catheterization. Death certificates were available for 65% of SCD patients who died, and 80% of these reported right heart failure or sudden cardiac death, a cause of death seen commonly in the general pulmonary arterial hypertension population ( 77 ). Multivariate analysis of hemodynamic variables identified pulmonary vascular resistance, transpulmonary gradient, and pulmonary artery systolic and diastolic pressures as predictors of mortality. SCD patients with PH who died had worse hemodynamic values than survivors: mean pulmonary artery pressures of 39 ± 9 versus 33 ± 7 mmHg (P < 0.001), transpulmonary gradient of 25 ± 10 versus 17 ± 8 mmHg (P = 0.003), and pulmonary vascular resistance of 279 ± 164 versus 189 ± 127 dyn•s/cm 5 (P = 0.017) strongly suggested that mortality rate in adults with SCD is proportional to severity of precapillary pulmonary vascular disease ( 64 , 76 ).

In the Brazilian study, 80 SCD patients were screened, and 26 with elevated estimated pulmonary artery systolic pressures by Doppler echocardiography had right heart catheterizations ( 66 ). Ten percent of patients had PH, with worse survival compared with the remaining patients. Patients with PH had lower hemoglobin and higher LDH levels, proteinuria, renal insufficiency, and lower 6-minute walk distance. The third study, in France, was also consistent with primary observations from the previously discussed trials ( 65 ). After exclusion of adults with greater disease severity, 6% of all screened adults had PH (46% precapillary and 54% postcapillary). Exclusion of subjects likely underestimated the true prevalence of PH, because markers of renal insufficiency, hepatic dysfunction, and iron overload are independent risk factors for high estimated pulmonary artery pressure in SCD. Patients with right heart catheterization–documented PH had lower hemoglobin and higher LDH values and higher prevalence of prior leg ulcers, and all deaths occurred in this subgroup ( 65 ).

All of these right heart catheterization screening studies likely underestimate PH prevalence, as not all patients with elevated TRV agreed to catheterization. The differences and similarities between these three studies are summarized in Table 2.

A comparison of SCD cohorts studied with right heart catheterization

Epidemiological studies of the associations between PH and other vasculopathic subphenotypes of SCD have been supported by mechanistically focused studies. The primary hypothesis that intravascular hemolysis releases cell-free plasma hemoglobin and arginase 1 to inactivate the NO signaling axis and redox balance was studied over the last 10 years in animal models and in vivo in humans. In addition to studies in humanized transgenic sickle cell mice, studies have now been performed in other diseases with significant intravascular hemolysis, including murine models of PNH, thalassemia, and malaria, and aged-blood transfusion models. Many of the studies test causality, with the addition of hemoglobin and hemoglobin inhibition by oxidation and haptoglobin therapy. We briefly review the preclinical and clinical experimental evidence below.

Vasomotor defect in SCD. SCD patients and sickle transgenic mice have impaired vasodilator responses to NO that are proportional to levels of plasma hemoglobin ( 16 , 78 – 80 ). In humans, impaired NO signaling, directly measured via venous occlusion strain-gauge plethysmography, correlates with high levels of plasma hemoglobin and LDH ( 16 ). This was recently confirmed in a study of SCD patients correlating high plasma hemoglobin levels with TRV elevations and impairments in flow-mediated vasodilation, a measure of endothelial NOS–dependent vasodilation ( 80 ). In the Berkeley sickle mouse, high plasma hemoglobin levels correlated with impaired blood flow responses to infusions of the NO donor sodium nitroprusside ( 81 ). In a recent study, a specific hemoglobin-scavenging peptide that depleted the levels of plasma hemoglobin restored endothelial NOS–dependent vasodilation ( 82 ).

PH in other animal models of hemolysis. Multiple mouse models of hemolysis exhibited increased plasma hemoglobin and increased plasma NO scavenging and developed spontaneous PH and right heart failure, including Berkeley sickle cell ( 78 ), spherocytosis ( 83 ), α-thalassemia ( 84 ), PNH ( 85 ), and alloimmune hemolysis mice ( 78 ).

NO resistance. NO resistance is characterized by impaired vasodilatory responses to infusions of NO donors, pulmonary and systemic vasoconstriction, and PH. In animals, inducing intravascular hemolysis or infusing hemoglobin or hemolysate can produce experimental NO resistance ( 86 – 89 ). This effect is attributable to hemoglobin and NO scavenging, as it can be blocked by oxidization of hemoglobin to methemoglobin with inhaled NO gas or by binding and clearance of hemoglobin with haptoglobin ( 86 , 89 – 91 ). Acute intravascular hemolysis induced by hypotonic water infusion in mice inhibits NO signaling and causes inflammation, an effect phenocopied by acute NO inhibition using chemical NO scavengers and reversed by an NO donor and haptoglobin ( 92 ). Haptoglobin prevents extravasation of free hemoglobin into interstitial spaces, where it scavenges NO ( 91 ).

Stored blood and vasomotor defect. Infusing aged stored blood into rodents ( 89 , 93 , 94 ) and humans ( 90 , 95 ) causes intravascular hemolysis, pulmonary and systemic hypertension, and vascular endothelial dysfunction (due to impaired NO signaling) that can be blocked by haptoglobin ( 96 ). These effects are not always observed in models or patient populations in which hemolysis is not as severe, the dose of transfused red cells is not large, and the existing compensatory reserves of haptoglobin, hemopexin, and catalytic antioxidants are not as chronically depleted as in SCD.

Malaria endothelial dysfunction. Animal and human malaria is associated with intravascular hemolysis, increases in plasma hemoglobin, and impaired NO signaling. Higher level of plasma hemoglobin correlates in patients with impaired endothelial function ( 97 , 98 ) and increased estimated pulmonary artery pressures ( 99 ). In animal models, it is linked to lowered NO scavenging and increased risk of death ( 21 ). Inhaled NO is protective in rodent models of malaria ( 21 , 100 , 101 ).

Free heme, another product of intravascular hemolysis, is released from free hemoglobin upon oxidation. Free heme is increasingly appreciated as an additional important mediator of inflammation and vascular injury ( 102 , 103 ). In sickle cell mice, free heme drives inflammation, vaso-occlusion, and coagulation that are blocked by the heme scavenger hemopexin ( 104 – 109 ). In cultured cells, heme promotes secretion of high levels of placenta growth factor ( 110 ), which in turn induces release of the potent vasoconstrictor endothelin 1 ( 111 ), a common mediator of PH. Heme is a potent source of oxidant stress, but it does not scavenge NO.

Hemoglobin oxidation is driven not only by reaction with NO ( 112 ), but also by reaction with a host of additional physiological oxidants ( 113 – 118 ). Ferric and ferryl forms of hemoglobin produced in SCD and other forms of hemolysis are highly reactive in promoting oxidation ( 119 – 121 ). Hemolysis also produces red cell microparticles that can deliver toxic heme to endothelial cells ( 122 , 123 ). Heme species appear to activate innate immune sterile inflammation pathways through TLR4 and NALP inflammasome signaling ( 104 , 105 , 124 , 125 ). As such, these hemolysis products are proposed to represent erythrocyte danger-associated molecular patterns (eDAMPs), which promote and propagate sterile inflammatory and oxidative stress, further impairing the redox balance ( 126 , 127 ). eDAMP release and oxidation of plasma hemoglobin to methemoglobin, which is necessary for the release of heme, are likely enhanced during acute vaso-occlusive episodes. To date, a careful stoichiometric analysis of cell-free hemoglobin levels, heme levels, and heme in microparticles during sickle vaso-occlusion has not been performed. Heme, hemoglobin, and red cell ADP activate platelets and stimulate platelet mitochondria to produce ROS and cause an oxidative enzymopathy of complex V (the ATPase), resulting in platelet activation, thrombospondin-1 and PDGF release, and promotion of inflammation and vasculopathy ( 128 ). eDAMPs trigger innate immune responses, perhaps in the setting of LPS-priming of the NALP3 inflammasome, and might be central to the sterile inflammation that is characteristic of sickle vaso-occlusion.

In this context, we propose that steady-state intravascular hemolysis primarily inhibits NO signaling and amplifies ROS formation, tipping the redox balance and producing endothelial dysfunction (Figure 2). With advancing age, this effect drives development of vasculopathic complications that characterize the subphenotypes of SCD most closely associated with hemolysis. Steady-state inflammation and increased blood viscosity also promote cellular adhesion and vaso-occlusion, leading to acute painful episodes and organ ischemia/reperfusion injury. These mechanisms intersect, perhaps during severe vaso-occlusive painful crisis when acute hemolysis is triggered and oxidant stress enhances hemoglobin oxidation and heme release. This intersection activates primed innate immune signaling pathways and the inflammasome, leading to multisystem injury and acute lung injury.

Contribution of intravascular hemolysis to vasculopathy and vasoocclusion. Intravascular hemolysis produces free hemoglobin, which drives Fenton reactions to produce oxidants and scavenges NO by a dioxygenation reaction. Intravascular hemolysis also releases red cell arginase 1 into plasma, where it can deplete plasma L-arginine (L-Arg), the required substrate for NO production by eNOS. Oxidized hemoglobin releases free heme, which can activate release of placenta growth factor (PIGF) and endothelin-1 (ET-1). These combined pathways contribute to chronic vasculopathy, platelet activation, and pulmonary hypertension. Heme also primes the innate immune system to acute rises in endogenous (HMGB1) and exogenous (LPS) ligands of TLR4. These in turn activate production of ROS, neutrophil extracellular traps (NETs), and downstream activation of the inflammasome, producing inflammatory cytokines and other mediators that promote expression of adhesion receptors and ligands on endothelium and blood cells. Intravascular hemolysis also releases adenine nucleotides, including ATP and ADP, which further contributes to platelet activation. There is also some evidence that adenosine binds receptors on red cells, resulting in increased 2,3-diphosphoglycerate and sphingosine-1-phosphate, associated with lower oxygen affinity of hemoglobin (not shown). Proteins on the surface of the activated endothelium (P-selectin, E-selectin, VCAM1, ICAM1) interact with adhesive platelets, neutrophils, and sickle erythrocytes, producing vasoocclusion and acute chest syndrome. Intravascular hemolysis also releases asymmetric dimethylarginine, which inhibits eNOS. CRP, C-reactive protein SAA, serum amyloid A Orn, ornithine. Adapted with permission from Gladwin, et al., Journal of Clinical Investigation ( 150 ).

The role of hyperhemolysis as a proximate cause of some SCD complications has drawn criticism. In some cases, this was a dispute over nomenclature in others, similar data were interpreted differently ( 11 , 12 ). Importantly, the debate has not centered on reproducibility, as strong associations between morbidity and mortality and measures of cell-free plasma hemoglobin and other markers of hemolysis, TRV, and PH remain robust. Similarly, strong consensus surrounds the vasoactivity and injurious effects of hemolysate, cell-free hemoglobin, and heme. Some of these controversies actually represent consensus, and are summarized in the following objections and responses:

Echocardiography-defined TRV is not adequate to diagnose PH. This is clearly true. TRV is a physiological biomarker representing PH risk, much as transcranial Doppler velocity represents stroke risk in children with SCA. PH diagnosis requires pulmonary artery catheterization. TRV ≥ 3 m/s appears to have about 75% specificity for PH in adults with SCD ( 64 , 65 ). TRV ≥ 2.5 m/s specificity is approximately 25% for PH, but the addition of abnormally short 6-minute walk distance ( 64 ) or elevated serum NT-proBNP ( 65 ) can enhance identification of high-risk patients in this intermediate TRV group. Elevated TRV unequivocally represents a higher risk of PH diagnosed by right heart catheterization ( 19 , 64 ), but this can be confounded by high cardiac output, error in the estimation of TRV, and other sources of variability. TRV also represents an elevated risk of impaired exercise tolerance, proteinuria, venous thromboembolism, and mortality (Figure 1 and refs. 58 , 129 , 130 ).

PH does not occur in 34% of SCD adults. This is correct. Approximately 6%–10% of SCD adults have PH defined by a mean pulmonary artery pressure greater than or equal to 25 mmHg, measured by pulmonary artery catheterization ( 64 – 66 ). However, another 25% of patients have mildly elevated TRV, which is prognostically significant, as discussed above, and mean pressures between 20 and 25 mmHg are abnormally high and likely consequential.

PH in SCD is caused by left ventricular diastolic dysfunction. Several echocardiography and right heart catheterization studies have shown that half of PH cases in SCD involve precapillary PH consistent with inappropriately high pulmonary vascular resistance, leading to right ventricular hypertrophy and failure ( 64 – 66 , 74 , 131 ). The other half comprise postcapillary PH, associated with a stiff left ventricle due to ventricular hypertrophy and linked to anemia and chronically high cardiac output ( 64 – 66 , 68 , 74 ). Even in patients with high left atrial pressures, the risk of death most closely associates with increases in the intrinsic pulmonary vascular resistance (high pulmonary vascular resistance and transpulmonary pressure gradient). An additional mechanism of cardiomyocyte dropout and cardiomyopathy has been found in sickle mice ( 132 ).

Serum LDH is not a good biomarker of hemolysis. In large population studies, LDH values in homozygous SS patients are correlated with higher levels of more direct markers of intravascular hemolysis, cell-free plasma hemoglobin, and red cell–derived microparticles ( 89 ). LDH values also correlate in human physiological studies with an impaired response to NO donor infusions. However, LDH has limitations as a marker of hemolysis, since it is released by lytic damage of almost any tissue, which occurs in patients with SCD. Its assay methodology varies among different clinical laboratories, complicating multicenter analyses. Serum LDH is a biomarker of intravascular hemolysis, which releases free hemoglobin and arginase. Both are integral to the hyperhemolysis model of NO scavenging ( 10 ). Phagocytosis of damaged red cells by macrophages or extravascular hemolysis is not expected to release free hemoglobin or LDH into plasma. Red cell survival studies do not distinguish between extravascular and intravascular hemolysis ( 133 ). Significant variability in serum LDH in steady-state SCD adults is provided by LDH isoforms originating from red cells but also found in renal cells ( 20 ). Until better biomarkers for intravascular hemolysis are available, only serum LDH, aspartate aminotransferase, and plasma hemoglobin can be used to imperfectly indicate intensity of intravascular hemolysis.

Decreased NO bioavailability cannot be the sole mechanism of vasculopathy in SCD. This is also correct. Published data evidence the involvement of oxidative stress ( 79 , 100 , 105 , 108 , 113 , 115 , 116 , 121 , 123 , 132 , 134 , 135 ), inflammation ( 9 , 22 , 27 , 32 , 101 , 105 – 108 , 115 , 124 – 127 , 134 ), dyslipidemia ( 135 – 138 ), microparticles ( 89 , 122 , 123 , 139 ), and vasoactive peptides ( 110 , 111 , 140 – 143 ). These additional pathways (depicted in Figure 2) are potentially additive or synergistic to intravascular hemolysis–like mechanisms. We note that hemolysis potently impairs redox balance, lowering NO signaling and enhancing pathological ROS signaling.

Markers of hemolysis do not correlate with red cell survival. A recent study limited to 13 measurements failed to find such correlations ( 133 ). This small study considered only 11 pediatric SCA patients with very low levels of basal hemolysis based on hydroxyurea treatment, many with α-thalassemia trait, and most having unusually high levels of HbF (10 of 13 measurements came from patients with HbF levels greater than 9%, including one of 33.8%). Measuring correlations of hemolysis markers in patients with limited hemolysis does not adequately test biomarkers. These studies should be performed in adult patients with clinically relevant ranges of hemolytic severity. Additionally, red cell survival (total hemolysis) in SCD is believed to be dominated by extravascular hemolysis ( 144 ), which is not the mechanism proposed to scavenge NO. Presently, plasma hemoglobin, serum LDH, and AST, with all their limitations, remain the best available biomarkers of intravascular hemolysis. Intravascular hemolysis must not be confused with extravascular hemolysis.


Paternité

Contribution: E.G., F.B., B.P.S., A.R., and M.E. designed the study E.G., F.V., F.L., A.R., and M.E. wrote the manuscript B.C., F.V., and A.R. prepared the data for analysis M.L. and A.R. performed statistical analysis B.C. and F.B. collected and verified data J.C., H.E., and C.K. helped with data management F.B., B.P.S., L.K., J.K., S.M.-M., and F.L. edited the manuscript and F.B., B.P.S., A.F., S.D., J.d.l.F., J.-H.D., M.Z., M.C.W., L.K., M.B., K.L., G.Y., J.K., N.D., M.K., G.M., J.A., P.L., B.N., Y.B., J.P.V., M.A., M.C., S.M.-M., V.R., P.B., and F.L. transplanted patients and provided data for the study. All authors read and approved the manuscript.

Conflict-of-interest disclosure: M.C.W. serves as Medical Director for ViaCord's Processing Laboratory. The remaining authors declare no competing financial interests.

A list of the members of Eurocord, the Pediatric Working Party of the European Society for Blood and Marrow Transplantation, and the Center for International Blood and Marrow Transplant Research appears in “Appendix.”


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