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Synthèse de fragments Fab d'immunoglobulines : où puis-je en savoir plus sur Fab ?

Synthèse de fragments Fab d'immunoglobulines : où puis-je en savoir plus sur Fab ?


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Je voulais connaître la réaction chimique impliquée dans la synthèse des Fab. Je l'ai cherché partout. Pas de chance. Je sais que je vais le trouver ici.

Tout ce que je sais pour l'instant c'est :

Fab est un fragment monovalent produit à partir d'IgG et d'IgM, constitué des régions VH, CH1 et VL, CL, liées par une liaison disulfure intramoléculaire.

La base moléculaire de Fab aura plus de sens.


Pour la génération de fragments Fab, des anticorps (éventuellement modifiés génétiquement) qui peuvent être fabriqués en grandes quantités par des cellules ou des animaux, sont utilisés. Les anticorps dans leur ensemble ne sont pas synthétisés.

Le fragment Fab est obtenu à partir d'anticorps utilisant l'enzyme papaïne, qui clive l'anticorps sur les liaisons disulfure dans la région charnière. Il en résulte deux fragments Fab (qui contiennent les sites de liaison à l'antigène) et un fragment Fc (qui contient la région constante de l'anticorps). Voir l'image (d'ici):

Si vous souhaitez approfondir le sujet, lisez l'une des références ci-dessous.

  1. Préparation et séparation de fragments Fab et Fc à partir d'immunoglobulines G humaines avec digestion à la papaïne
  2. Fragmentation des IgG à l'aide de la papaïne

Les FAbs sont génétiquement modifiés et non synthétisés organiquement en tant que tels. Cet article du PNAS décrit bien la construction d'une bibliothèque de phages (virus) pour générer une grande quantité de FAb différents et cribler les FAb avec l'affinité recherchée pour l'épitope (antigène) : http://www.pnas.org/content/95/11 /6157.court


Service de coupe Fab Abzyme

Biolabs créatifs a mis en place une plate-forme technique pour obtenir des fragments Fab d'anticorps avec l'utilisation de protéases spécifiques, ce qui peut grandement satisfaire vos besoins de recherche expérimentale. Nous avons de nombreuses années d'expérience dans la production d'anticorps d'organismes modèles personnalisés, de l'expression de gènes ou de la synthèse de peptides au marquage d'anticorps et au service d'anticorps biotinylés avi-tag.

Classification des enzymes et avantages

Les gènes Fab-Cutter A et Fab-B sont tous deux dérivés de Streptococcus pyogenes (S. pyogenes), exprimé par E. coli, et obtenu par purification en plusieurs étapes. Pour différents sous-types d'humains, de souris, de moutons, de chèvres et d'autres espèces, l'enzyme peut effectuer une digestion rapide en un seul point de l'immunoglobuline IgG.

  • Fab-Cutter A
  • Le site de clivage enzymatique est situé au-dessus de la région charnière de l'immunoglobuline IgG
  • Acquérir des fragments Fab et des fragments Fc dimères
  • Site de coupe enzymatique unique, coupe rapide
  • Fab-Cutter B
  • Le site de clivage enzymatique est situé sous la région charnière de l'immunoglobuline IgG
  • Acquérir des fragments F(ab')2 et des fragments Fc dimères
  • Peut également être appliqué aux IgG2a et IgG3 de souris
  • Site de coupe enzymatique unique, coupe rapide

Flux de travail de notre service

Les scientifiques de Creative Biolabs se consacrent à la personnalisation d'un plan de projet complet en fonction de vos besoins, vous permettant de passer le moins de temps possible pour atteindre les résultats attendus.

  • Nous fournissons une variété d'anticorps que vous pouvez personnaliser, contactez-nous pour obtenir des ressources en anticorps
  • Selon vos scénarios d'application, nous vous proposons des solutions de digestion
  • Nous fournissons un service professionnel d'expérimentation de digestion

Fonctionnalités chez Creative Biolabs

Creative Biolabs possède une vaste expérience dans le service de découpe Fab abzyme. Notre équipe scientifique s'engage à étudier sur le terrain depuis de nombreuses années, avec une riche expérience. Les produits de digestion que nous avons obtenus sont de meilleure qualité et peuvent être utilisés pour des essais pilotes avec une petite quantité d'anticorps.


Résumé graphique

Divulgation: Les auteurs déclarent le(s) intérêt(s) financier(s) concurrent(s) suivant(s) : E.N., A.C.G., A.P. et A.C.P. a déposé un brevet pour utiliser le peptide du domaine du cou dans des liposomes ciblés en folate pour l'administration de médicaments spécifiques. M.R. est un employé de MC Toxicology Consulting. député et M.S. sont des employés d'EXBIO Praha.

Le financement: Ce travail a reçu un financement du septième programme-cadre de l'Union européenne (accord de subvention FP7/2007-2013 NMP4-LA-2009-228827 NANOFOL) et du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 (accord de subvention n° 683356 - FOLSMART), outre le Fondation portugaise pour la science et la technologie dans le cadre du financement stratégique de l'unité UID/BIO/04469/2013 et COMPETE 2020 (POCI-01-0145-FEDER-006684) et de l'opération BioTecNorte (NORTE-01-0145-FEDER-000004) financé par le Fonds européen de développement régional dans le cadre de Norte2020.


Par rapport aux IgG entières, les fragments Fab peuvent pénétrer les cellules et les tissus et se lier plus facilement aux antigènes grâce à leur encombrement stérique inférieur. De plus, l'absence de région Fc empêche les fragments Fab de liaison non spécifique aux récepteurs Fc.

Lorsque le fragment Fc est d'intérêt, la papaïne est par conséquent l'enzyme de choix. La papaïne est principalement utilisée pour générer des fragments Fab, mais elle peut également être utilisée pour générer des fragments F(ab&rsquo) 2 lorsqu'elle est utilisée dans des conditions physico-chimiques spécifiques.


Service de production d'anticorps Fab

Les fragments de liaison à l'antigène (Fab) proviennent de la digestion enzymatique ou chimique d'un anticorps complet (comme une IgG). Ces fragments sont les domaines de liaison à l'antigène d'une molécule d'anticorps, contenant une région variable de chaîne lourde (VH), une région variable de chaîne légère (VL), une région constante de chaîne lourde 1 (CH1) et une région constante de chaîne légère (CL) [1]. Les fragments Fab peuvent être obtenus de deux manières : via la synthèse recombinante ou le clivage enzymatique de l'anticorps parent [2].

Avec des années d'expérience en recherche dans le domaine de la construction et de l'expression d'anticorps recombinants, Biologics International Corp (BIC) propose des services de production de fragments d'anticorps, qui incluent Fab, scFab, Fab', F(ab')2production de , scFv, diabody, triabody, minibody et scFv-Fc. N'hésitez pas à nous contacter pour toute information complémentaire concernant les fragments d'anticorps. Nous sommes toujours heureux de vous aider.

Les fragments Fab d'une taille d'environ 50 KDa sont les domaines de liaison à l'antigène d'une molécule d'anticorps, contenant un domaine constant et un domaine variable de chacune des chaînes lourde et légère. Les fragments qui contiennent des thiols de pont disulfure sont appelés fragments Fab’, tandis que ceux dépourvus du groupe fonctionnel thiol sont appelés fragments Fab [2]. En raison de leur petite taille, les Fab/Fab' peuvent pénétrer les tissus plus efficacement et être éliminés du sang plus rapidement. Comme ils ne contiennent pas de fragments Fc, les Fab/Fab' n'interfèrent pas avec la détection des anticorps anti-Fc.

Fab Fragments Construction

Pour produire des fragments Fab, deux méthodes différentes peuvent être utilisées. La méthode principale est via le clivage enzymatique/chimique de l'anticorps entier, dans lequel l'anticorps entier est clivé par une enzyme (telle que la papaïne, la pepsine et la ficine) pour former F(ab')2 fragments, suivie de la réduction de ces fragments pour donner des fragments Fab [2]. Une méthode alternative est la synthèse recombinante de F(ab')2 fragments d'anticorps, suivie d'une réduction chimique de ces fragments pour donner des unités Fab.

Bibliothèque d'anticorps Fab

Actuellement, la plupart des fragments d'anticorps recombinants sont générés par des bibliothèques d'anticorps phage display [3]. La bibliothèque d'anticorps Fab est avantageuse de plusieurs manières importantes : premièrement, par rapport aux anticorps monoclonaux, qui sont très laborieux et longs à produire, la bibliothèque d'anticorps Fab peut sélectionner rapidement et efficacement de nouveaux anticorps difficiles à obtenir grâce à la technologie des hybridomes. Deuxièmement, comme les anticorps scFv, il pourrait être plus facile de générer des anticorps Fab avec des affinités plus élevées. Troisièmement, les avantages des fragments Fab sont très stables lors d'un stockage à long terme [4] et sont compatibles avec les antisérums de détection courants sans nécessiter de réingénierie. Si vous avez besoin d'un anticorps contre certains antigènes inhabituels, contactez-nous, notre bibliothèque d'anticorps avec une riche diversité et à grande échelle vous aidera à trouver un anticorps idéal.

Plus de formats fabuleux

A F(ab')2 fragment, qui conserve une petite partie de la région charnière Fc, a deux régions de liaison à l'antigène qui peuvent augmenter l'affinité avec l'antigène. Réduction de F(ab')2 fragments produit deux fragments Fab' monovalents, qui ont un groupe sulfhydryle libre qui est utile pour la conjugaison avec d'autres molécules.

Bien que l'utilisation de méthodes de clivage enzymatique/chimique pour générer des fragments Fab soit pratique et efficace, elle nécessite une grande quantité d'anticorps monoclonal comme matériau de départ. Un fragment Fab à chaîne unique (scFab) peut conduire à une fonction et à une production améliorées de fragments Fab. Selon certaines études [3], les fragments scFab présentent une capacité de liaison à l'antigène supérieure par rapport à Fab et compensent certains des inconvénients de la production de Fab soluble dans E. coli.

Vous avez des formats d'anticorps en tête ? Contactez-nous avec vos idées, laissez-nous voir ce que nous pouvons faire pour vous.


Structure de base et classes d'immunoglobulines

Dans cet article, nous discuterons de la structure de base et des classes d'immunoglobulines.

Les anticorps sont les glycoprotéines spécifiques (Immunoglobuline) produites par les cellules en réponse à une stimulation par un antigène (Immunogène) et capables de réagir spécifiquement avec cet antigène. Chaque immunoglobuline (en bref, elles s'écrivent Ig) a la même structure de base composée de quatre chaînes polypeptidiques (deux chaînes lourdes et deux chaînes légères).

Ces chaînes sont maintenues ensemble par des forces non covalentes et des ponts disulfure covalents. Chaque chaîne a une partie variable et une partie constante d'acides aminés (Fig. 10.3). En divisant la molécule d'immunoglobuline à l'aide de différentes enzymes, il a été possible d'apprendre les fonctions des différentes parties de la molécule.

L'enzyme, la papaïne divise la molécule en deux fragments Fab (Fab = fragment antigen binding) et un fragment Fc (Fc = fragment cristallisable), tandis que l'enzyme Pepsine divise la molécule en un F(ab)2 – fragment et plusieurs petits peptides généralement inactifs.

Les différences d'activités biologiques, ainsi que des propriétés physico-chimiques distinctes et des localisations différentes ont conduit à la division des anticorps en différentes classes et sous-classes.

La structure de base de l'Ig est illustrée ci-dessous (Fig.10.3) :

1. Structure de base des immunoglobulines :

UNE. Chaînes lourdes et légères :

Toutes les Ig ont une structure à quatre chaînes comme unité de base. Une paire de la chaîne polypeptidique contient environ deux fois plus d'acides aminés que l'autre paire. Elles sont appelées chaînes lourdes (H) (50-70 KDa.) et chaînes légères (L) (25 KDa.) respectivement.

B. Liaisons disulfure :

1) Inter-chaîne : La chaîne lourde et la chaîne légère et les deux chaînes lourdes sont maintenues ensemble par des liaisons disulfure inter-chaînes.

2) Intra-chaîne : Au sein de chacune des chaînes polypeptidiques, il existe également des liaisons disulfure intra-chaîne.

C. Régions variable (V) et constante (C) :

La chaîne H et la chaîne L peuvent être divisées en deux régions en fonction de la variabilité des séquences d'acides aminés.

1) Chaîne légère : région variable, VL (110 acides aminés) et région constante, CL (110 acides aminés)

2) Chaîne lourde : région variable, VH (110 acides aminés) et région constante, CH (330-440 acides aminés).

L'anticorps (Ig) se lie à l'antigène par la région V des chaînes lourdes et légères, c'est-à-dire une partie du fragment Fab. Le fragment Fc – est responsable des activités biologiques.

La région dont les bras de la molécule d'anticorps forment un ‘Y’ est appelée la région charnière, car il y a une certaine flexibilité dans la molécule à ce stade.

La molécule d'Ig est repliée en régions globulaires, dont chacune contient une liaison disulfure intra-chaîne. Ces régions sont appelées domaines.

1) Domaines de la chaîne légère – VL et CL

F. Oligosaccharides :

Les glucides sont attachés au CH2 domaine dans la plupart des immunoglobulines.

Structure de la région variable :

UNE. Régions hypervariables (HVR) ou régions déterminant la complémentarité (CDR) :

La comparaison des séquences d'acides aminés des régions variables des Ig’ montre que la majeure partie de la variabilité réside dans trois régions (HVRI1, HVRI2, HVRI3) appelées région hypervariable ou régions déterminant la complémentarité.

B. Régions cadres (FR) :

Les régions entre les CDR dans les régions variables sont appelées régions de cadre (FR1, FR2, FR3, FR4).

2. Classes et sous-classes d'immunoglobulines :

Les Ig peuvent être divisées en cinq classes différentes chez l'homme, à savoir IgA, IgD, IgE, IgG et IgM (tableau 10.2). Parmi ces IgA, IgD, IgE et IgG se présentent sous forme de monomères de structure de base H2L2 c'est-à-dire deux chaînes polypeptidiques lourdes et deux chaînes polypeptidiques légères. Les IgA sériques peuvent polymériser en dimère (H2L2)2 et l'oligomère (H2L2)m formes.

L'IgA se présente principalement sous la forme d'un gradateur lié à un composant de sécrétion et à une chaîne polypeptidique, la chaîne J (J=join). L'IgM dans le sérum se présente sous forme de pentamère (H2L2)S où les monomères sont liés entre eux par des ponts disulfure et une chaîne J. La classification des Ig est principalement basée sur la nature des chaînes H et L (tableau 10.2).

Les classes d'Ig peuvent être divisées en sous-classes basées sur de petites différences dans les séquences d'acides aminés dans les régions constantes des chaînes lourdes. IgG est composé de quatre sous-classes, à savoir IgGl (chaîne H y-1, 60 à 70 % dans le sérum), IgG2 (chaîne H y-2, 14 à 20 % dans le sérum), IgG3 (chaîne H y-3 , 4-8% dans le sérum) et IgG4 (y-4 H-chaîne, 2-6% dans le sérum). Parmi ceux-ci, les IgG4 peuvent se lier aux mastocytes pour accélérer la réaction allergique dans certains cas.

IgA est composé de deux sous-classes, à savoir IgAl (chaîne α-1 H) et IgA2 (chaîne α-2 H). Les IgE sont impliquées dans l'accélération des réactions allergiques, bien que leur concentration dans le sérum soit normalement très faible (0,001 % des Ig totales). Des taux élevés d'IgE sont trouvés dans le sérum de patients souffrant de maladies allergiques. Certaines cellules comme les leucocytes basophiles et les mastocytes possèdent des récepteurs pour le fragment Fc des IgE.


Synthèse de fragments Fab d'immunoglobulines : où puis-je me renseigner sur Fab ? - La biologie

En plus de modifier la partie Fc d'un anticorps, la région variable d'une immunoglobuline peut être reformatée en une variété de fragments différents tels que Fab, F(ab)'2, scFv, VHH et minibodies, ou peuvent être combinés avec une seconde spécificité pour fabriquer des anticorps bispécifiques. Les formats d'anticorps plus petits peuvent être exploités pour leur pénétration améliorée dans les tumeurs/tissus et leur relative facilité d'expression dans des systèmes non mammifères.

Nous pouvons reconcevoir des anticorps et des fragments d'anticorps dans pratiquement n'importe quel format, dont certains sont présentés ci-dessous. Une fois produits, les anticorps peuvent être caractérisés à l'aide d'une vaste gamme de tests, tels que ELISA, la détermination de l'affinité à l'aide de Biacore ou un test biologique approprié.

F(ab)’2 conserve la liaison bivalente d'une IgG sans la partie Fc, qui serait autrement impliquée dans le recrutement des fonctions effectrices par son interaction avec les récepteurs Fcγ.

Les Fabs ont environ un tiers de la taille d'une IgG entière et sont monovalents. Ce fragment plus petit a une pénétration améliorée dans les tissus et une élimination plus rapide de la circulation, et peut également bénéficier de l'absence de fonctions effectrices médiées par les récepteurs Fcγ. Les Fabs peuvent facilement être exprimés dans des systèmes non mammifères.

Les scFv sont conçus en liant les domaines variables des chaînes lourdes et légères en une molécule à chaîne unique qui fait environ un cinquième de la taille d'une IgG entière. Les scFv sont couramment utilisés pour la présentation sur phage et peuvent être exprimés liés à une variété de protéines de fusion pour un ciblage spécifique.

Les VHH ne sont constitués que du domaine variable de la chaîne lourde et représentent environ un dixième de la taille d'une IgG entière. Naturellement présents chez les camélidés tels que l'alpaga et le lama, ainsi que chez les requins, les VHH sont très stables et se prêtent à la fusion avec d'autres protéines et peuvent être liés aux domaines Fc pour former des anticorps à chaîne lourde uniquement.

Anticorps bispécifiques

Les anticorps bispécifiques consistent en deux domaines de liaison qui ciblent des antigènes séparés, permettant à deux antigènes d'être liés simultanément par une construction. Cela peut être particulièrement utile pour diriger une cellule effectrice vers une cellule cible. Des anticorps bispécifiques ou des fragments d'anticorps peuvent être fabriqués dans une variété de formats différents et peuvent être adaptés à vos besoins, en fonction de l'application.

Les exemples ci-dessus fournissent un échantillon des capacités d'Abzena et nous pouvons reconcevoir des anticorps et des fragments d'anticorps dans pratiquement n'importe quel format. Une fois produits, les anticorps peuvent être caractérisés à l'aide d'une vaste gamme de tests de liaison (tels que l'utilisation d'ELISA), la détermination de l'affinité à l'aide de la résonance plasmonique de surface Biacore ou dans un test biologique approprié.

Travailler avec Abzena

Les services d'Abzena sont adaptés à chaque projet pour s'assurer que les objectifs sont atteints ou dépassés. Des équipes de projet expérimentées sont affectées à chaque étude en se concentrant sur l'avancement des projets jusqu'aux résultats dans un minimum de temps. Nos clients nous considèrent largement comme des partenaires professionnels et attentifs qui fournissent des résultats de qualité.

Pour obtenir plus d'informations, un devis ou pour planifier une téléconférence, veuillez nous contacter.


Expression de l'anticorps Fab (fragment de liaison à l'antigène) activement soluble et du Fab fusionné à la GFP dans le cytoplasme Escherichia coli

L'expression de fragments d'anticorps recombinants dans l'espace cytoplasmique de Escherichia coli et le processus de repliement pour restaurer la structure et l'activité de ces anticorps ne sont pas efficaces. Ici, des anticorps de liaison à l'antigène de fragment (Fab) contre le miroestrol et le désoxymiroestrol (MD-Fab) et leurs fusions avec une protéine fluorescente verte (GFP) ont été exprimés. Les MD-Fabs réactifs ont été exprimés avec succès sous forme soluble et active dans le cytoplasme du SHuffle® T7 E. coli souche. Concernant la construction de MD-Fab seule, VH-CH1 pourrait associer VL-CL en Fab dans le cytoplasme oxydant du E. coli souche, et aucun repliement in vitro supplémentaire n'a été nécessaire. Dans le cas des fusions avec GFP, lorsque le C-terminal de VH-CH1 était lié à l'extrémité N-terminale de la GFP, la réactivité de liaison MD-Fab était conservée, mais l'activité fluorescente de la GFP interférait. Lorsque l'extrémité C-terminale de GFP était liée à l'extrémité N-terminale de VL-CL, l'activité de liaison de MD-Fab n'a pas été observée. Les MD-Fabs construits avaient une spécificité plus élevée envers le désoxymiroestrol que le clone d'anticorps monoclonal parental 12G11. En conclusion, les MD-Fabs pourraient être exprimés en utilisant SHuffle® T7 E. coli cellules. Ce procédé pourrait être considéré comme une méthode économique, productive et efficace pour produire des fragments d'anticorps pour les techniques de dosage immunologique.


Classes d'immunoglobulines

Il existe 5 classes d'immunoglobulines IgG, IgA, IgM, IgE et IgD telles que déterminées par la présence de séquences d'acides aminés uniques dans les régions constantes de la chaîne lourde. Les propriétés structurelles de base de ces classes d'immunoglobulines sont brièvement discutées ici. Structure générale de cinq grandes classes d'immunoglobulines (anticorps)
(Source de l'image : immunologie Kubay)

Immunoglobuline G (IgG)

La molécule d'IgG est constituée de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères ou deux . Il existe quatre sous-classes d'IgG humaines, distinguées par des différences de séquence de chaîne et numérotées en fonction de leurs concentrations sériques moyennes décroissantes : IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4. En savoir plus sur l'immunoglobuline G (IgG) et sa fonction ici.

Immunoglobuline A (IgA)

La molécule d'IgA est constituée de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères ou deux .

L'IgA existe principalement sous forme de monomère dans le sérum mais dans les sécrétions externes, elle (l'IgA sécrétoire) est présente sous forme de dimère ou de tétramère lié par un polypeptide de la chaîne J. En savoir plus sur l'immunoglobuline A et sa fonction ici.

Immunoglobuline M (IgM)

La molécule d'IgM est constituée de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères ou deux . L'IgM a un domaine constant de chaîne lourde « supplémentaire » et l'absence d'une région charnière dans la chaîne .

L'IgM a deux formes d'IgM monomérique (liées à la membrane sur les cellules B) et d'IgM pentamérique (sécrétées par les plasmocytes). Dans l'IgM pentamérique, cinq unités monomères sont maintenues ensemble par des liaisons disulfure qui relient leurs domaines de chaîne lourde carboxy-terminale (Cμ4/Cμ4) et leurs domaines (Cμ3/Cμ3) maintenus ensemble par un polypeptide lié à Fc appelé chaîne J (jointure) . En savoir plus sur l'immunoglobuline M (IgM) et ses fonctions ici.

Immunoglobuline E (IgE)

La molécule d'IgE est constituée de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères κ ou deux . L'IgE a un domaine constant de chaîne lourde « supplémentaire » et l'absence d'une région charnière dans la chaîne . L'immunoglobuline E (IgE) est bien connue pour son rôle dans la médiation des réactions d'hypersensibilité immédiate. Plus d'informations sur les IgE seront publiées plus tard dans un autre article de blog.

Immunoglobuline D (IgD)

La molécule d'IgD est constituée de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères ou deux λ. L'IgD est généralement co-exprimée avec l'IgM à la surface des cellules B matures.


Synthèse de fragments Fab d'immunoglobulines : où puis-je en savoir plus sur Fab ? - La biologie

Nous présentons ici une description approfondie de la structure des anticorps et de divers fragments d'anticorps. Nous discutons des principales applications des anticorps ainsi que des avantages et des inconvénients de l'utilisation d'anticorps de taille normale par rapport à des fragments. Nous fournissons ensuite un aperçu des études utilisant des fragments d'anticorps et une discussion sur les récepteurs d'anticorps appelés récepteurs Fc.

Les anticorps sont des glycoprotéines d'immunoglobulines (Ig) produites par les plasmocytes (cellules B) en réponse à des molécules antigéniques étrangères (immunogènes). La fonction principale des anticorps est de se lier spécifiquement à ces antigènes étrangers pour les désactiver et/ou les marquer pour la destruction par le système immunitaire, protégeant ainsi l'hôte de l'infection. Il existe plusieurs classes d'anticorps. La première partie de ce résumé se concentre sur les anticorps conventionnels de taille normale, les anticorps de classe IgG et IgM, qui sont fortement utilisés dans une multitude d'applications biomédicales de recherche, de diagnostic et thérapeutiques.

L'unité de base d'un anticorps conventionnel est une unité à quatre polypeptides constituée de deux chaînes lourdes identiques et de deux chaînes légères identiques maintenues ensemble par des liaisons disulfure. Les chaînes légères sont plus courtes, avec des poids moléculaires inférieurs à ceux des chaînes lourdes. La forme générale d'un anticorps est un Y, avec une région charnière flexible (interdomaine) au centre du Y. La flexibilité de la région charnière interdomaine est importante pour la liaison bivalente d'un anticorps [2], permettant aux deux poches de liaison d'interagir avec des sites antigéniques à des distances variables. Chaque chaîne polypeptidique a une région constante, qui ne varie pas de manière significative entre les anticorps, et une région variable, qui est spécifique à chaque anticorps particulier. La notation commune pour la région variable de la chaîne légère est VL et pour la région constante de chaîne légère est CL (Figure 1). La notation est similaire pour la variable chaîne lourde (VH) et les régions constantes (CH) avec CH1, CH2, et CH3 désignant les différents domaines de région constante de la chaîne lourde. Les glucides sont normalement attachés au CH2 domaines des chaînes lourdes. La région cristallisable du fragment (Fc) ne contient que des régions constantes des chaînes lourdes (CH), mais la région de liaison à l'antigène du fragment (Fab) comprend à la fois un domaine constant et les domaines variables des chaînes lourdes et légères (VH et CL). Le fragment région variable FV ne contient que les deux domaines variables (Figure 1). Voir anticorps de souris pour une discussion sur les isotypes d'immunoglobuline, les sous-classes et le nombre de domaines d'immunoglobuline.

Chaque anticorps complet a deux poches de liaison à l'antigène, situées dans le FV régions, et peut se lier à deux antigènes (liaison bivalente). Cependant, si les deux antigènes sont trop proches (≤3 nm), ou trop éloignés (≥29nm), l'anticorps ne peut se lier qu'à un seul antigène (liaison monovalente) [2]. Il existe un changement d'affinité significatif entre les liaisons monovalentes et bivalentes avec un changement de 1 500 fois des valeurs de Kd [2].

La structure des anticorps spécifiques est disponible dans la Structural Antibody Database (SAbDab), une base de données organisée de structures d'anticorps accessibles au public, ainsi que des outils de modélisation structurelle, qui sont mis à jour chaque semaine à partir de la Protein Data Bank (PDB) [3].

Des anticorps conventionnels de taille normale ont été utilisés dans la recherche pour la détection de protéines via des analyses Western blot [4], l'immunohistochimie [5] et les tests ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) [6] pendant des décennies. Des anticorps grandeur nature ont également été développés pour des applications de diagnostic telles que les tests de grossesse et la détection de bactéries et de virus dans le sang, comme un ELISA qui détecte le VIH. De plus, des anticorps classiques de taille normale sont couramment utilisés dans la thérapeutique des maladies. Par exemple, l'infliximab est l'un des nombreux anticorps disponibles qui reconnaissent le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) et il est utilisé dans le traitement de la maladie de Crohn et de la polyarthrite rhumatoïde [7, 8]. Le trastuzumab, ou Herceptin, est un anticorps qui se lie au récepteur 2 du facteur de croissance épidermique et est utilisé dans le traitement du cancer du sein métastatique [9]. Il existe également plusieurs thérapies à base d'anticorps, dont le Muromonab [10], administrées aux receveurs de greffe pour prévenir le rejet d'allogreffe.

Bien que les anticorps classiques de taille normale puissent tous deux être utilisés pour des applications thérapeutiques, il y a des avantages et des inconvénients à utiliser l'anticorps complet. Un avantage important des anticorps conventionnels est le fait que la région Fc engage la réponse immunitaire du corps et peut cibler les antigènes liés pour la destruction. Cette région Fc peut également être un inconvénient dans certaines applications cliniques car la réponse immunitaire qu'elle provoque typiquement peut être préjudiciable à la santé du patient. De plus, les anticorps de taille normale ne peuvent pas bien pénétrer dans certains tissus en raison de leur taille relativement importante [11]. Dans certains cas, lors de l'utilisation d'anticorps de taille normale pour des applications de diagnostic, le domaine Fc peut provoquer une liaison non spécifique significative, ce qui peut nuire aux applications de détection.

Pour de nombreuses applications, des fragments d'anticorps sont préférables. Des fragments d'anticorps peuvent être produits par des mécanismes chimiques ou génétiques. La fragmentation chimique utilise des agents réducteurs pour rompre les liaisons disulfure dans la région charnière et la digestion de l'anticorps avec des protéases comprenant la pepsine, la papaïne et la ficine. La construction génétique de fragments offre la possibilité de créer une multitude de molécules contenant des fragments, chacune avec des caractéristiques de liaison et fonctionnelles uniques.

La digestion chimique et par une protéase d'anticorps IgG ou IgM de taille normale donne des fragments de liaison à l'antigène (Fab Figure 1) et des fragments Fc, composés uniquement des domaines CH2 et CH3 de la chaîne lourde. Les méthodes biochimiques de génération de fragments d'anticorps produisent des outils utiles pour des applications diagnostiques et thérapeutiques, mais elles sont assez laborieuses et nécessitent une grande quantité de matière première d'anticorps.

Les fragments de liaison à l'antigène produits par digestion biochimique comprennent Fab, (Fab')2, Fab' et FV, tous dépourvus de la région Fc. Les fragments F(ab) monovalents ont un site de liaison à l'antigène, tandis que les fragments divalents (Fab')2 ont deux régions de liaison à l'antigène qui sont liées par des liaisons disulfure. Deux fragments F(ab) individuels sont produits lorsqu'un anticorps de taille normale est digéré avec l'enzyme papaïne. Un fragment F(ab')2, qui conserve une partie de la région charnière, est produit par digestion par la pepsine d'anticorps IgG ou IgM. La réduction des fragments F(ab')2 produit 2 fragments Fab' monovalents, qui ont un groupe sulfhydryle libre qui est utile pour la conjugaison à d'autres molécules. FV les fragments sont le plus petit fragment fabriqué à partir du clivage enzymatique des anticorps de classe IgG et IgM (Figure 1). FV fragments ont le site de liaison à l'antigène constitué du VH et VL régions, mais il leur manque les régions constantes de Fab (CH1 et CL) (Figure 1, panneau de droite). Le VH et VL sont tenus ensemble en FV fragments par des interactions non covalentes. Les fragments peuvent être générés à l'aide de kits disponibles dans le commerce, par exemple, le kit de fragmentation F(ab')2 de G-Biosciences [12].

Les méthodes de génie génétique permettent la production de fragments variables à chaîne unique (scFv), qui sont FV fragments de type qui se composent du VH et VL domaines liés par un peptide de liaison flexible modifié (Figure 1) [13]. La manipulation de l'orientation des domaines V et de la longueur du linker crée différentes formes de FV molécules [14]. Lorsque le lieur a au moins 12 résidus de long, les fragments scFv sont principalement monomères (comme le montre la figure 1) [14]. Les lieurs de 3 à 11 résidus longs produisent des molécules scFv incapables de se replier en un F fonctionnelV domaine. Ces molécules s'associent à une seconde molécule scFv, ce qui crée un diacorps bivalent [15]. Si la longueur du linker est inférieure à trois résidus, les molécules scFv s'associent en tricorps ou tétracorps [14]. Par exemple, Tao Y et al ont généré un diabody VH-VL avec un linker court GGGGS et scFv avec un linker long GTTAASGSSGGSSSGA [16]. Les scFv multivalents possèdent une plus grande affinité de liaison fonctionnelle à leurs antigènes cibles en raison de la présence de deux autres sites de liaison à l'antigène cible, ce qui réduit le taux de désactivation du fragment d'anticorps [17]. Les minibodies sont des scFv-CH3 protéines de fusion qui s'assemblent en dimères bivalents [18]. De petits fragments scFv avec deux domaines variables différents peuvent être générés pour produire des fragments bis-scFv bispécifiques capables de lier simultanément deux épitopes différents [19]. Des méthodes génétiques sont également utilisées pour créer des dimères Fab bispécifiques (Fab2) et des trimères Fab trispécifiques (Fab3) [19]. Ces fragments d'anticorps sont capables de lier simultanément 2 ou 3 antigènes différents, respectivement. Les chercheurs utilisent souvent des fragments scFv pour stabiliser les complexes protéiques dans les études de structure des protéines [20].

En plus des anticorps conventionnels, les espèces de camélidés et de requins (squalidae) contiennent un sous-ensemble d'anticorps particuliers à chaînes lourdes (hcAb) exclusivement composés d'homodimères à chaînes lourdes dépourvus de chaînes légères [21, 22]. Les portions Fab de ces anticorps, appelées VHH chez les camélidés et VNAR chez les requins, sont les plus petites régions de liaison à l'antigène trouvées naturellement [23]. Les nanobodies sont des domaines recombinants dérivés de VHH capables de se lier à des antigènes, souvent clonés à partir de bibliothèques de phages VHH telles que celles contre les protéines betacoronarivus S [24] ou contre le domaine RBD de la protéine de pointe SARS-CoV-2 [25]. Leur thermodynamique de liaison et leurs structures ont été étudiées ( [26] et référence dans celui-ci). Les nanobodies sont très stables et peuvent être facilement produits en grande quantité en utilisant des systèmes d'expression de protéines simples courants tels que les bactéries (les anticorps fonctionnels conventionnels de taille normale sont difficiles à exprimer correctement dans un système bactérien), représentant ainsi un outil prometteur pour la recherche et à des fins thérapeutiques. , en particulier dans les domaines de la microscopie à super-résolution, de la spectrométrie de masse et de la dégradation ciblée des protéines [27]. Les nanocorps peuvent également être délivrés à l'intérieur de cellules vivantes par conjugaison avec des peptides [28, 29], ou in vivo [30], ou exprimés directement in vivo et reconnaître ses cibles in vivo. Les nanobodies contre RFP ou GFP, lorsqu'ils sont conjugués avec des colorants Atto rouge lointain, ont atteint un grossissement de 118 fois des signaux fluorescents par rapport à GFP ou RFP, et ont été utilisés pour générer une connectivité neuronale de souris pour tout le corps [31]. Ils ont également été utilisés pour stabiliser l'état actif des protéines dans des études structurales [32]. Un système d'expression avec de multiples nanocorps concaténés contre différentes souches grippales est à l'étude comme moyen de générer un vaccin universel contre la grippe [33]. Recombinant anti-IgG secondary nanobodies have great potential to replace widely used polyclonal secondary antibodies produced using animals [34].

Nanobodies have the unique ability to cross the blood-brain barrier [35, 36] however, nanobodies tend to be processed and cleared very quickly from the body [37]. Nanobodies can be used for methods like immunoprecipitation, for example, RFP-Trap MA from Chromotek [38], or coupled to fluorescent proteins to track intracellular targets in live cells in real-time [39].

About 10% of bovine immunoglobulins contain an unusually long third heavy-chain complementarity-determining region (CDR 3H) with a large number of cysteine residues [40-42]. These cysteines pair to form disulfide bonds which leads to a stalk-and-knob like structure in the antigen binding domain [42]. This exceptionally long CDR3H domain with the long-stalk contributes to the diversity of bovine antibody specificity.

Intrabodies, or intracellular antibodies, refer to antibodies or their fragments (usually of scFv design) expressed directly inside cells or in animals in vivo through an expression vector. For example, Dong JX et al developed several nanobodies against neuronal proteins for intracellular expression as intrabodies [43]. One important consideration/caveat is the reducing intracellular environment which diminishes the affinity of an antibody or antibody fragment whose binding with the antigen is dependent on intradomain disulfide bonds. Another consideration is that intrabodies tend to aggregate. Kabayama H et al designed intrabodies with a net engative charge even at the lowest cytoplasmic pH 6.6 to generate ultra-stable cytoplasmic antibodies [44]. Intrabodies are used as alternatives to pharmacological inhibitors to target specific endocytic participants. For instances, expression of a single-chain variable fragment (scFv) derived from the 3B12A monoclonal antibody against the TDP-43 nuclear export signal in HEK293A cells or after in utero electroporation of its expression vector promoted the proteolysis of TDP-43 aggregates in cultured cells and embryonic mouse brain [45]. Virus-mediated delivery into the nervous system of an scFv antibody against the RNA recognition motif 1 of TDP-43 reduced microgliosis in a mouse model of acute neuroinflammation and mitigated cognitive impairment, motor defects, TDP-43 proteinopathy, and neuroinflammation in transgenic mice expressing TDP-43 mutations linked to amyotrophic lateral sclerosis [46]. The potential of intrabodies as a therapeutical modality remains to emerge.

An antibody fragment can also be linked with a cell-import tag, such as an IPTD tag [47], to facilitate its entry into cells.

Antibody fragments offer certain advantages over a full-size antibody for some applications. This topic was reviewed by Nelson [48]. One advantage of fragments over full-size antibodies is that antibody fragments are smaller than conventional antibodies and generally lack glycosylation, allowing their production in prokaryotic expression systems, which provide time and cost savings. Additionally, fragments are small enough to infiltrate into some tissues that full-size antibodies are unable to penetrate, which aids in many therapeutic and immunohistochemical procedures [11]. Furthermore, the lack of Fc domain is a substantial advantage for primary antibodies used in immunohistochemistry and other detection applications because they have greatly reduced non-specific binding to the Fc receptor. One scFv that is commonly used in diagnostics is the NC10 antibody against influenza neuraminidase. The MOC-31 antibody against epithelial cell adhesion molecule Ep-CAM is an scFv commonly used in as a cancer therapy. Diabodies, triabodies and tetrabodies have potential uses in applications such as radioimmunotherapy and diagnostic in vivo imaging [49]. However, fragments that lack the Fc domain are degraded in the body much more rapidly than conventional antibodies [50], and are unable to elicit Fc-mediated cytotoxic processes unless they are conjugated to an effector moiety [51], which requires further optimization for antibody fragment-based therapeutics.

Although various antibody fragments offer certain advantages, they are not commonly utilized in experiments. In the more than 60,000 articles manually curated by Labome only a few articles cited applications of antibody Fab fragments. The Roche anti-digoxigenin Fab antibody fragments ( 11093274910) and anti-fluorescein Fab antibody fragments ( 11426338910) are generated in sheep and produced through digestion with papain. Anti-digoxigenin Fab fragments were used for in situ hybridizations since the RNA probes are labeled with digoxigenin [52-54]. They were also used to perform protein folding analysis to study the process of single calmodulin molecule folding through single-molecule force spectroscopy [55]. F(ab) fragments of anti-mouse secondary antibodies are often used to block endogenous mouse Ig during immunostaining, for example, AffiniPure Fab fragment Donkey antimouse IgG from Biozol (JIM-715-007-003) [56].

B Shen et al performed whole mount staining of mouse half bones with Alexa Fluor 647-AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti-chicken IgY at 1:250, Alexa Fluor 488-AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti-rabbit IgG at 1:250, Alexa Fluor 488-AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti-rabbit IgG (at 1:250 (all from Jackson ImmunoResearch) [57]. Invitrogen Alexa Fluor 546-conjugated goat anti-rabbit IgG F(ab')2 fragment was used to perform immunohistochemistry to investigate the role of sFLT-1 in the maintenance of the avascular photoreceptor layer in mouse models [58] and Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab')2 fragment of rabbit anti-goat IgG (H+L) was used in immunohistochemistry to investigate the mechanism of tip link regeneration in auditory hair cells [59].

Fc receptors (FcRs) are molecules expressed primarily on/in innate immune cells, that recognize and bind the Fc domain of antibodies and thereby initiate a cell-based immune response. The diverse functions of FcRs reflect the wide range of protective or modulating roles of antibodies, including mediating the neutralization and clearance of targeted substrates, as well as the programming of adaptive immunity [60]. The biological functions of FcRs are regulated by immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs) and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIMs), that act as the receptor’s interface with activating and inhibitory signaling pathways, respectively. Thus, signaling by ITAMs can elicit cell activation, phagocytosis and endocytosis, whereas signaling by ITIMs has an inhibitory effect on cell activation [61]. FcRs have been described for all classes of immunoglobulins and some of them are discussed below.

This family includes FcγRI, FcγRII, FcγRIII and their isoforms. They are responsible for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ACDP) [60].

Another receptor that binds IgG is neonatal Fc receptor (FcRn), which is involved in the transfer of passive humoral immunity from a mother to her fetus. FcRn also protects IgG from degradation in vivo, explaining their long half-life in the serum [62]. This phenomenon has led to the development of better therapeutic antibodies by introducing alterations in the Fc region to promote the Fc-FcRn interaction.

They include the high-affinity FcεRI, which is capable of binding monomeric IgE, and the low-affinity C-type lectin FcεRII, which interacts preferentially with complex IgE. FcεRI mediates the immediate hypersensitivity response of many allergic reactions by stimulating degranulation and the release of a range of inflammatory mediators on mast cells and basophils [63]. FcεRII exists both in a membrane-bound form that delivers a downregulating signal for IgE synthesis [63], as well as soluble fragments that generate an opposing upregulation on IgE synthesis [64]. Its role in transcytosis of IgE-allergen complexes in human airway and the intestinal epithelium is actively being investigated as a potential target for allergic airway inflammation as a result of food allergies [65, 66].

The sole member of the IgA receptor group, FcαRI, is expressed only in cells of the myeloid lineage. It plays a role in both pro- and anti-inflammatory responses depending on the state of the IgA bound. While binding of secretory IgA (SIgA) present at mucosal sites has anti-inflammatory effects including prevention of pathogen invasion, binding of serum IgA leads to inflammatory responses. FcαRI also regulates neutrophil viability depending on the inflammatory microenvironment [67].

TRIM21 can be distinguished from other FcRs as it shows a broad antibody specificity. It can bind IgG, IgM and IgA [68-70]. It is also expressed by cells of most histogenic lineages [71]. TRIM21 participates in antibody-mediated interference of viral replication by targeting cytosolic virus-antibody complexes for proteasomal degradation.

Binding of Fc domains to FcRs can have undesired effects in monoclonal antibody-based analytical methods such as immunohistochemistry (IHC), fluorescence activated cell sorting (FACS) and chromatin immunoprecipitation (ChIP). Non-specific binding to FcRs may introduce background noise that can lead to detection of false positives. Solutions to deal with this problem include the use of (i) isotype controls for gating, (ii) serum to broadly compete for the receptors involved in non‐specific binding, or (iii) purified IgG to block Fc receptors specifically [72]. Innovex Fc Receptor blocker #NB309 can be used to block paraffin or frozen sections during IHC or IC experiments [73] or BD Biosciences #553142 [73, 74], Miltenyi Biotec Fc receptor block [75, 76] for flow cytometry. For example, Chopra S et al blocked FcγR binding with 5 μg/ml TruStain fcX (anti-mouse CD16/32, clone 93) from BioLegend during flow cytometry and cell sorting [77].

Dr. Macarena Fritz Kelly from São José dos Campos, SP, Brazil, contributed the section about Fc receptors in September, 2018.


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