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E6. Liens et références - Biologie

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  1. Teusink, B et al. La glycolyse de la levure peut-elle être comprise en termes de cinétique in vitro des enzymes constitutives ? Tester la biochimie. Eur J Biochem 2000 Sep; 267 (17): 5313-29.
  2. Li C, Donizelli M, Rodriguez N, Dharuri H, Endler L, Chelliah V, Li L, He E, Henry A, Stefan MI, Snoep JL, Hucka M, Le Novère N, Laibe C (2010) , ressource organisée et annotée pour les modèles cinétiques quantitatifs publiés. BMC Syst Biol., 4:92.

Contributeurs

  • Prof. Henry Jakubowski (College of St. Benedict/St. John's University)

Base structurelle de l'inhibition de la protéase principale du SRAS-CoV-2 par le médicament antinéoplasique carmofur

Il a été démontré que le médicament antinéoplasique carmofur inhibe la protéase principale du SRAS-CoV-2 (M pro). Ici, la structure cristalline aux rayons X de M pro en complexe avec le carmofur révèle que le groupe réactif carbonyle du carmofur est lié de manière covalente au Cys145 catalytique, tandis que sa queue d'acide gras occupe le sous-site hydrophobe S2. Le carmofur inhibe la réplication virale dans les cellules (EC50 = 24,30 M) et est un composé phare prometteur pour développer un nouveau traitement antiviral pour COVID-19.

COVID-19, une maladie virale hautement infectieuse causée par le coronavirus SARS-CoV-2, s'est propagée dans le monde entier depuis son apparition en décembre 2019, provoquant une pandémie sans précédent. Le nombre de cas confirmés dans le monde continue de croître à un rythme rapide, mais, à l'heure actuelle, il n'existe aucun médicament ou vaccin spécifique disponible pour contrôler les symptômes ou la propagation de cette maladie.

Génome d'ARN de 30 000 nt. Le premier cadre de lecture ouvert code deux produits de traduction, les polyprotéines 1a et 1ab (pp1a et pp1ab) 1,2, qui sont transformés en protéines non structurelles matures par la protéase principale (M pro) et une protéase de type papaïne 3 . M pro a été proposé comme cible thérapeutique pour le développement de médicaments anti-coronavirus 4,5,6. Nous avons précédemment criblé plus de 10 000 composés et identifié le carmofur comme un composé pouvant inhiber M pro in vitro, avec une concentration inhibitrice demi-maximum (IC50) de 1,82 µM (réf. 7 ).

Le carmofur (1-hexylcarbamoyl-5-fluorouracile) est un dérivé du 5-fluorouracile (5-FU Fig. 1a) et un agent antinéoplasique approuvé. Le carmofur est utilisé pour traiter le cancer colorectal depuis les années 1980 8 et a montré des avantages cliniques pour les cancers du sein, de l'estomac et de la vessie 9,10,11 . On pense que la cible du carmofur est la thymidylate synthase 12,13, mais il a également été démontré qu'elle inhibe la céramidase acide humaine (AC) 14 par modification covalente de sa cystéine catalytique 15 .

une, La structure chimique du carmofur. b, Le mode de liaison du carmofur au SARS-CoV-2 M pro . La courbe rouge représente le polypeptide SARS-CoV-2 M pro avec la chaîne latérale de Cys145 en saillie. c, La structure d'un seul protomère. Les trois domaines sont affichés dans trois couleurs différentes. Le centre catalytique est situé dans le carré en pointillés. , Vue agrandie du centre catalytique. Les résidus qui participent à la liaison du carmofur sont présentés sous forme de modèles de bâton. Le carmofur est présenté sous la forme d'un modèle en forme de boule et de bâton avec les carbones en magenta. Une molécule d'eau est présentée comme une sphère rouge. e, Une vue tournée du site de liaison, mais avec la surface enlevée. Le cercle en pointillé rouge met en évidence la liaison covalente C-S.

Les détails moléculaires de la façon dont le carmofur inhibe l'activité de M pro sont restés non résolus. Ici, nous présentons maintenant une structure cristalline aux rayons X de 1,6 Å du SARS-CoV-2 M pro en complexe avec du carmofur (Fig. 1b, c et tableau supplémentaire 1). En accord avec les études précédentes 4,5,16,17,18, M pro forme un homodimère (protomères A et B) liés par symétrie cristallographique (Extended Data Fig. 1a,b). Tous les résidus (1-306) dans le polypeptide peuvent être tracés dans la carte de densité électronique. Chaque protomère est composé de trois domaines (Fig. 1c) - les domaines I (résidus 10-99), II (résidus 100-184) et III (résidus 201-303) - et une longue région en boucle (résidus 185-200) qui relie les domaines II et III. La poche de liaison au substrat se situe dans la fente entre les domaines I et II et présente les résidus de dyade catalytique Cys145 et His41 (Fig. 1c,d). La poche de liaison au substrat est divisée en une série de sous-sites (y compris S1, S2, S4 et S1'), chacun hébergeant un résidu d'acide aminé unique mais consécutif dans le substrat. Ser1 dans chaque protomère interagit avec Phe140 et Glu166 de l'autre protomère pour stabiliser le sous-site S1 (Extended Data Fig. 1c), une caractéristique structurelle qui est essentielle pour la catalyse 7 .

La carte de densité électronique montre sans ambiguïté que la fraction acide gras (C7H14NO) de carmofur est lié à l'atome Sγ de Cys145 par une liaison covalente 1,8 , tandis que la queue d'acide gras est insérée dans le sous-site S2 (Fig. 1d,e). Cette observation suggère que le groupe sulfhydryle de Cys145 attaque le groupe carbonyle électrophile du carmofur, entraînant une modification covalente de Cys145 et la libération de la fraction 5-FU (Fig. 1b et données étendues Fig. 2a). En plus de la liaison covalente C-S, l'inhibiteur est stabilisé par de nombreuses liaisons hydrogène et interactions hydrophobes (Fig. 1e et Extended Data Fig. 2b). L'oxygène carbonyle du carmofur occupe le trou oxyanionique et forme des liaisons hydrogène (3,0 ) avec les amides du squelette de Gly143 et Cys145, imitant l'intermédiaire oxyanion tétraédrique formé lors du clivage de la protéase (Fig. 1e). La queue d'acide gras, qui apparaît dans une conformation étendue, s'insère dans le sous-site hydrophobe volumineux S2 (composé des chaînes latérales de His41, Met49, Tyr54 et Met165 et de la partie alkyle de la chaîne latérale de Asp187 Fig. 1d,e). Les interactions hydrophobes sont principalement dues aux chaînes latérales de His41, Met49 et Met165, qui sont toutes parallèles à la partie alkyle de la queue d'acide gras de l'inhibiteur (Fig. 1e et Extended Data Fig. 2b).

Le mécanisme de modification covalente par le carmofur est différent de celui de l'inhibiteur N3 7,19, qui modifie de manière covalente Cys145 par addition de Michael du groupe vinyle. Les structures de M pro –carmofur et M pro –N3 sont globalement similaires (déviation efficace (r.m.s.d.) de 0,286 pour tous les atomes de Cα). Les plus grandes différences de conformation se produisent dans la poche de liaison au substrat, avec la colonne vertébrale entourant le carmofur dans une position légèrement plus vers l'extérieur par rapport à la structure complexe M pro-N3 (données étendues Fig. 3a). Une autre différence est que le carmofur n'occupe que le sous-site S2 (Fig. 1d), alors que N3 occupe quatre sous-sites (S1, S2, S4 et S1′ Extended Data Fig. 3b,c). Le cycle lactame de N3 est situé dans le sous-site S1, qui est rempli par une molécule de DMSO dans la structure M pro-carmofur (Extended Data Fig. 3b,c). Ces observations démontrent le potentiel d'élaboration structurelle du carmofur et seront utiles pour la conception de dérivés plus puissants contre le M pro du SARS-CoV-2.

Nous avons précédemment montré que le traitement avec 10 M d'ebselen (concentration efficace demi-maximale, EC50 = 4,67 M) a inhibé l'infection des cellules Vero par le SRAS-CoV-2, alors que le carmofur n'a pas montré d'activité antivirale détectable à cette concentration 7 . Ici, nous avons déterminé l'effet inhibiteur du carmofur contre l'infection par le SRAS-CoV-2 sur les cellules Vero E6, comme décrit précédemment dans la réf. 20 (Fig. 2). En mesurant l'ARN viral dans le surnageant cellulaire, nous avons déterminé la CE50 valeur pour le carmofur comme 24,30 M (Fig. 2a). Pour vérifier ce résultat, nous avons fixé les cellules infectées et les avons colorées à l'aide d'antisérums contre la protéine de nucléocapside virale (NP), observant une diminution des niveaux de NP après traitement au carmofur (Fig. 2b). Nous avons également effectué des tests de cytotoxicité pour le carmofur dans des cellules Vero E6 et déterminé une concentration cytotoxique demi-maximale (CC50) valeur de 133,4 µM (Fig. 2c). Ainsi, le carmofur a un indice de sélectivité (SI) favorable de 5,36, mais une optimisation supplémentaire sera nécessaire pour développer un médicament efficace.

Les cellules Vero E6 infectées par le SRAS-CoV-2 à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,05 ont été traitées avec différentes concentrations de carmofur. une, Des dosages quantitatifs d'amplification en chaîne par polymérase avec transcription inverse (qRT-PCR) ont été effectués pour mesurer le nombre de copies virales dans le surnageant cellulaire. Les oui l'axe indique le pourcentage d'inhibition du virus par rapport à l'échantillon traité avec du DMSO (véhicule). Les données sont affichées en moyenne ± s.e.m., m = 6 répétitions biologiques. b, Images d'immunofluorescence pour les NP intracellulaires. 24 h après l'infection, les cellules ont été fixées et les taux de NP intracellulaires ont été surveillés par immunofluorescence. La chloroquine (CQ, 10 M) a été utilisée comme témoin positif 20 . Les résultats sont représentatifs de trois répétitions biologiques. Barres d'échelle, 400 μm. c, Test de viabilité cellulaire. Les oui l'axe représente le pourcentage de viabilité cellulaire par rapport à l'échantillon traité au DMSO (véhicule). Les données sont affichées en moyenne ± s.e.m., m = 3 répétitions biologiques. Données pour les graphiques dans une et c sont disponibles en tant que données sources.

En conclusion, la structure cristalline de M pro en complexe avec le carmofur montre que le composé modifie directement le Cys145 catalytique du SARS-CoV-2 M pro. Notre étude fournit également une base pour la conception rationnelle d'analogues du carmofur avec une efficacité inhibitrice améliorée pour traiter le COVID-19. Étant donné que M pro est hautement conservé parmi tous les coronavirus, le carmofur et ses analogues peuvent être efficaces contre un spectre plus large de ces virus.


Introduction

Les papillomavirus humains (HPV) sont associés à diverses lésions épithéliales, notamment les verrues génitales bénignes et les néoplasies intraépithéliales cervicales [1]. À ce jour, plus de 250 types de HPV ont été identifiés et chacun de ces génotypes est associé à une infection à des sites anatomiques particuliers. Le VPH6 peut être le type d'alpha-papillomavirus à faible risque le plus répandu et est couramment associé aux verrues génitales [2]. Par exemple, les verrues anogénitales sont principalement causées par le VPH6 (famille Papillomaviridae, genre Alphapapillomavirus, espèce 10) [3], ce qui représente un fardeau important à la fois pour le système de santé et pour les patients. De même, un tiers des écoliers néerlandais ont des verrues cutanées, dont environ 20 % consultent un médecin chaque année [4]. De manière générale, ces infections sont classées comme « non cancérigènes » ou « à faible risque », elles attirent souvent une attention négative, et provoquent ainsi une détresse psychologique importante [5]. Cependant, certaines variantes du VPH6 sont classées comme « cancérigènes », car elles provoquent des infections pouvant entraîner des affections potentiellement mortelles, telles que le carcinome amygdalien et malin du larynx et/ou le papillome laryngé malin [6,7,8,9].

À ce jour, des recherches approfondies ont été menées pour étudier la variation de séquence entre les types de VPH cancérigènes. Néanmoins, seules des données limitées sont disponibles concernant les variantes du VPH6, malgré leur impact significatif sur la santé humaine. Structurellement, le VPH est un virus à ADN circulaire double brin qui code pour les protéines E1, E2, E4, E5, E6, E7, L1 et L2 [10]. Les HPV infectent les cellules via la couche basale de l'épithélium stratifié, et l'expression des gènes viraux est étroitement liée au programme de différenciation endogène des cellules hôtes [11]. Parmi les protéines codées par HPV, E6 et E7 se sont avérées être les protéines HPV pathogènes les plus importantes. Il a déjà été démontré qu'ils fonctionnent comme des oncoprotéines qui régulent de manière critique la tumorigenèse induite par le VPH [12]. De plus, il a également été démontré qu'ils sont essentiels pour maintenir les formes extrachromosomiques du VPH dans les cellules basales indifférenciées [13].

Les analyses de variabilité génétique se sont avérées essentielles pour faciliter une meilleure compréhension de l'évolution du papillomavirus. Un certain nombre de variantes cancérigènes ont été identifiées dans les variantes du VPH isolées des populations du sud-ouest de la Chine, cependant, seules des recherches limitées ont été menées pour identifier les variantes du VPH à faible risque. Ainsi, la présente étude visait à analyser E6 et E7 variabilité de la séquence parmi les HPV6 isolés à partir d'échantillons de papillome cervical prélevés sur des patients du sud-ouest de la Chine. Des analyses phylogénétiques ont été menées pour comparer les séquences nucléotidiques identifiées avec celles précédemment décrites dans d'autres populations ethniques. De plus, la structure secondaire des séquences identifiées a été prédite pour évaluer l'impact probable des variantes à faible risque sur la fonction virale globale. Les résultats de l'étude pourraient fournir des données importantes pour la recherche sur la prévention du VPH6, le diagnostic, la thérapeutique et même la conception de vaccins thérapeutiques à base de protéines E6 et E7 dans le sud-ouest de la Chine.


UTILISER L'HISTOIRE DE LA BIOLOGIE POUR METTRE EN VALEUR LE CONTEXTE SOCIAL

Pour aider les étudiants à comprendre que la recherche biologique peut être influencée par des personnes au sein de la communauté scientifique ainsi qu'en dehors de celle-ci, les instructeurs peuvent utiliser l'histoire de la biologie pour fournir un contexte pour le développement de principes, méthodes et concepts clés. En retraçant les étapes de la découverte à travers le temps, les élèves voient que la connaissance biologique est le résultat de l'activité humaine, chaque chercheur s'appuyant sur le travail de l'autre par la communication, la compétition et la collaboration. Bien que les étudiants puissent avoir du mal à embrasser un chemin long et non linéaire de découverte biologique, ils peuvent également être rassurés par le fait que chaque découverte n'a pas été réalisée seule. En partageant l'histoire de la biologie avec les étudiants, nous présentons une vision plus réaliste de la construction des connaissances biologiques : des hypothèses opposées ou des résultats contradictoires sont courants les chemins de la découverte peuvent impliquer des limitations technologiques, des défis expérimentaux, des faux pas, des mauvais tournants et la culture et la politique peut influencer l'orientation de la recherche. En partageant des récits historiques de découverte, nous favorisons le développement de la pensée critique grâce à la création d'environnements d'apprentissage dans lesquels les élèves se sentent à l'aise pour exprimer leurs propres idées fausses, prendre des risques et poser des questions.

L'histoire de la théorie de l'évolution

Une sélection minutieuse de sujets à partir du dossier historique peut être utilisée pour améliorer l'apprentissage des étudiants, mais comme le temps et l'espace sont limités dans nos cours, nous devons être judicieux dans nos choix. En 2003, un groupe de travail de biologistes a été invité à définir quatre ou cinq concepts biologiques centraux qui devraient être enseignés dans chaque cours de biologie de premier cycle pour le Comité directeur sur les critères et les repères pour un apprentissage accru de l'enseignement STEM de premier cycle (NRC, 2003). Après de nombreuses heures de délibération, le groupe a signalé que l'évolution était le seul concept commun à tous les cours de biologie, et que d'autres concepts (c'est-à-dire la théorie des germes, la théorie cellulaire, l'énergétique, le dogme central) devraient être enseignés dans les cours qui nécessitent spécifiquement cette connaissance. . Compte tenu de ce résultat, il semble qu'il serait sage d'enseigner le développement historique de la théorie de l'évolution, car cette théorie est le fondement de toute la biologie.

Bien que la plupart des éducateurs en biologie n'aient aucune formation formelle en histoire de la biologie, nous avons la chance d'avoir accès à de nombreuses ressources qui mettent en évidence les événements et les personnes importants qui ont façonné la pensée évolutionniste. D'excellentes sources qui évaluent de manière critique les contributions des chercheurs à la théorie de l'évolution comprennent « Evolution for Teachers » produit par PBS, le projet « Understanding Evolution » hébergé par l'Université de Californie (UC) à Berkeley et le livre en ligne de Robert Young. La métaphore de Darwin : la place de la nature dans la culture victorienne (Tableau 3). Ces ressources reconnaissent que les idées d'autres disciplines étaient essentielles au développement de la théorie de l'évolution. Le site de l'UC Berkeley propose une carte conceptuelle superposée sur une chronologie qui démontre les quatre domaines disciplinaires qui ont contribué à notre compréhension actuelle de l'évolution. Dans le livre de Young, des extraits de Darwin Origine de l'espèce, Charles Lyell Principes de géologie, et Thomas Malthus Essai sur le principe de population sont analysés pour les points communs. En visionnant ces extraits ensemble dans un seul texte, les élèves apprennent que bien que Darwin se soit concentré sur le processus de spéciation animale, c'est le travail de Malthus sur l'économie et la condition sociale qui a finalement poussé Darwin à faire le saut de la sélection artificielle à la sélection naturelle. Le philosophe social Herbert Spencer a ensuite adapté le concept et a inventé l'expression « survie du plus apte » dans Principes de biologie publié en 1864. Ces ressources conduisent naturellement à des conversations sur le « Darwinisme social » et le développement ultérieur des pratiques d'eugénisme social aux États-Unis, qui peuvent être illustrées par des images de « Eugenics Image Archive » hébergées par le Dolan DNA Learning Center (tableau 3). L'évolution étant le seul principe directeur de toute la biologie, il est important que les étudiants soient conscients des fondements historiques de cette théorie et reconnaissent que même aujourd'hui, il existe un débat sur les phénomènes biologiques qui contribuent le plus à la spéciation. Ce dernier sujet est abordé plus directement dans un livre récent qui se concentre sur les contributions du transfert horizontal de gènes (Margulis et Sagan, 2003).

Tableau 3. Ressources pour l'histoire de la biologie

L'histoire de la biologie cellulaire, de l'embryologie et de la génétique

Les sources qui retracent l'histoire de la biologie cellulaire, de la biologie du développement et de la génétique juxtaposent souvent des extraits de textes historiques originaux avec une analyse critique, résument l'histoire à l'aide de chronologies ou reconstruisent l'histoire à travers des biographies, des projets d'histoire orale et des entretiens. Le projet « Discovery of the Cell » (DoTC) reflète les contributions des historiens des sciences et comprend des extraits de textes historiques, en accordant une attention particulière à « l'importance et la valeur conceptuelle d'une découverte particulière » en utilisant un schéma de codage couleur sur tout le site Web qui remonte jusque dans les années 1500 (tableau 3). GarlandScience a publié un DVD intitulé « Exploring the Living Cell », qui contient une section historique qui utilise des dessins et du texte pour illustrer le travail des premiers biologistes cellulaires (tableau 3). Un autre projet intéressant, "The Embryo Project Encyclopedia", est consultable par lieu, personne ou objet, et fournit des résultats sous la forme d'une carte qui décrit les liens historiques et relationnels de ces objets (Arizona State University, tableau 3). Dont la vision de la vie contient une histoire riche et détaillée de la biologie des cellules souches précoces qui sert de base à la recherche actuelle sur les cellules souches (Maienschein, tableau 3). L'UC Berkeley a créé un projet d'histoires orales autour du même sujet, en utilisant la proposition 71 en Californie comme étude de cas pour documenter la relation entre la science et la société à travers des entretiens avec des biologistes des cellules souches et des décideurs (tableau 3). Bien que le projet de Berkeley n'utilise pas de textes historiques, sa construction illustre la nécessité de préserver l'histoire en train de se faire, ce qui est également observé dans les entretiens du « Program in Bioscience and Biotechnology Studies », qui capturent les expériences, les passions et les relations de biologistes qui étaient sur le point d'amener la biotechnologie dans une nouvelle direction. Des changements similaires dans la recherche biologique sont reflétés dans « Language and Science », qui est le premier des trois chapitres de Refigurer la vie (Tableau 3). Ici, Keller retrace l'émergence de la génétique en tant que nouveau domaine de la biologie et suggère qu'à travers son langage associé, la génétique a conduit à la marginalisation du domaine de longue date de l'embryologie. Ce type de retraçage rappelle aux étudiants qu'à mesure que les biologistes continuent de faire des découvertes, de nouveaux domaines se développeront et les vieilles idées pourraient s'estomper pour réapparaître dans un nouveau contexte. Par exemple, certaines formes larmarckiennes d'héritage sont reconnues aujourd'hui comme la conséquence d'événements de programmation épigénétique, qui peuvent être sensibles à l'environnement (Jablonka et al., 1998).

Un mot de prudence dans l'utilisation de l'histoire de la biologie pour enseigner la découverte

Un article intitulé « Comment Pas to Teach History of Science », met en garde les enseignants contre l'utilisation de l'histoire comme outil pour considérer la science comme une « découverte triomphale » ou une « erreur pathologique » (Allchin, 2000). Suggérer que certains scientifiques dans le passé sont des « perdants » plutôt que des contributeurs à un domaine d'étude plus vaste entraîne trois résultats négatifs : cela suggère qu'il existe une « bonne réponse », que tout résultat qui ne rapproche pas le chercheur de cette réponse prédite et définie est inutile, et cette biologie est statique. L'un des « perdants » les plus célèbres décrits dans les manuels de biologie est Jean-Baptiste Lamarck. Une représentation biaisée de Lamarck est renforcée lorsqu'il est opposé à Charles Darwin. Cependant, Lamarck et Darwin ne considéraient pas leurs théories de l'évolution comme s'excluant mutuellement et, plus récemment, les travaux de Lamarck ont ​​été ressuscités par une meilleure compréhension de la façon dont les facteurs environnementaux peuvent avoir un impact sur la modification épigénétique du génome. En utilisant ces théories ensemble plutôt qu'en opposition, les instructeurs peuvent souligner l'importance du contexte pour déterminer lorsque, et comment, ces théories expliquent divers phénomènes biologiques. Une multiplicité d'approches pour aborder le même problème est utile car elle permet aux élèves d'être plus courageux dans la mise en avant de nouvelles idées.

On voudra également s'abstenir d'enseigner « l'histoire des livres de cuisine », présentant des recherches ou des découvertes biologiques en dehors de leurs contextes historiques (Allchin, 2000). Lorsque les élèves lisent des textes « historiques », ils peuvent critiquer l'approche expérimentale d'un biologiste, mais utilisent les connaissances actuelles pour le faire. Pour aider les élèves à se replacer dans le temps, on peut utiliser un excellent ensemble de biographies historiques en Chasseurs de microbes, publié à l'origine en 1928 (tableau 3). L'auteur utilise un langage approprié à l'époque, et s'il peut embellir ici et là, il capte les personnalités ainsi que les alliances politiques et nationales de divers biologistes cellulaires (Summers, 1998). Une caractéristique importante de ces récits est qu'ils n'hésitent pas à souligner « l'erreur pathologique » associée au besoin d'avoir « raison » et les frustrations qui accompagnent les expérimentations qui ne se sont pas déroulées comme prévu (voir chapitres Koch et Metchnikoff). Lorsqu'ils demandent aux élèves de réfléchir à la façon dont ces personnages historiques auraient pu améliorer leurs modèles expérimentaux, il faut leur rappeler de rester fidèles aux technologies et aux connaissances disponibles à ce moment-là. Ces histoires peuvent être contextualisées davantage à l'aide d'autres articles qui approfondissent le contexte social. Dans le cas de Louis Pasteur et de Robert Koch, des études de cas montrent comment la politique de guerre a déclenché l'animosité entre les individus et les écoles de pensée concurrentes en ce qui concerne les pratiques de santé publique (Ullmann, 2007). Collectivement, ces perspectives illustrent que la technologie est un outil important et peut être un moteur ou un facteur limitant dans la découverte biologique.

Enfin, nous recommandons de cesser d'utiliser l'histoire pour présenter les découvertes biologiques comme des produits d'un heureux hasard, car cela pourrait convaincre les étudiants que la biologie n'est pas une bonne expérimentation mais plutôt une chance stupide. Si nous faisons un effort conscient pour démontrer que les connaissances sont construites au fil du temps par plusieurs chercheurs qui mettent des années à acquérir leur expertise, les étudiants peuvent être moins enclins à se précipiter pour trouver des réponses aux problèmes et à consacrer du temps à des observations et des analyses significatives. Les chronologies qui montrent les contributions de plusieurs disciplines à une découverte majeure, telle que l'ADN étant la molécule de l'hérédité, illustrent le pouvoir d'intégration et la grande quantité d'expertise nécessaire pour arriver à cette découverte (Figure 1, chronologie construite par classe Figure 2, chronologie construite par les élèves). Les sources historiques et les chronologies mettent en évidence l'un des facteurs les plus influents de la découverte biologique, qui n'est pas le hasard, mais la sagacité - la capacité par l'expérience de distinguer les écarts significatifs du bruit expérimental ou de l'erreur humaine (Gest, 1997).

Figure 1. Exemple de chronologie génétique construite en classe. Cette image a été construite lors d'une session de classe d'un cours d'introduction à la génétique dans lequel les étudiants ont été invités à intégrer les personnes, l'histoire et les expériences qui ont conduit à une compréhension de l'ADN en tant que matériau de transformation. Des événements et des publications de la physique, de la chimie et de la biologie sont tissés ensemble des techniques courantes de l'époque sont mises en évidence, y compris l'utilisation de la radioactivité pour tracer des molécules subissant divers processus moléculaires. Le clin d'œil à « Bill et Doug » fait référence à une parabole qui aide les élèves à discerner les différences entre les approches biochimiques et génétiques et les mérites des deux dans la résolution de problèmes (Kellogg, 1994 Sullivan, 1993). L'accent est mis sur les maux sociaux de l'époque qui ont conduit à la découverte, notamment les maladies infectieuses (Griffiths, Hershey-Chase, les postulats de Koch), et l'attention est accordée à des personnalités moins connues telles que Meischer, Franklin et Wallace.

Figure 2. Exemple de chronologie de la métagénomique et de l'obésité construite par les étudiants. Lorsqu'on lui a demandé de soumettre un résumé écrit des lectures, qui comprenait des articles de recherche et de synthèse, cet étudiant a spontanément fourni un calendrier supplémentaire. Cette soumission est intervenue à mi-chemin d'un cours de niveau intermédiaire sur le projet du génome humain et illustre de multiples approches et méthodes pour comprendre les contributions génétiques et environnementales au problème interdisciplinaire contemporain de l'obésité.


Résultats

Interaction de HPV16 E6 et Daxx dans les cellules C33A

Les contrôles positifs (complexes E6 avec anticorps anti-E6 ou Daxx avec anticorps anti-Daxx) ont pu être détectés à partir du surnageant lytique de cellules C33A transfectées avec pcDNA3.1(+)/HPV16 E6 ou pcDNA3.1(+)/Daxx. L'anticorps anti-E6 pourrait détecter un complexe précipité par l'anticorps anti-Daxx ou l'anticorps anti-E6. De même, l'anticorps anti-Daxx pourrait détecter un complexe précipité par l'anticorps anti-Daxx ou l'anticorps anti-E6 (Fig. 1A).

Interaction de HPV16 E6 et Daxx dans les cellules C33A. UNE Liaison de HPV16 E6 et Daxx évaluée par western blot. La photo montre des taches représentatives pour : (a) le surnageant lytique cellulaire avec l'anticorps anti-Daxx (contrôle positif pour Daxx) (b) le complexe de Daxx tiré vers le bas par l'anticorps anti-Daxx avec l'anticorps anti-Daxx (c) le complexe de Daxx attiré par l'anticorps anti-E6 avec l'anticorps anti-Daxx (d) le complexe attiré par l'anticorps IgG avec l'anticorps anti-Daxx (contrôle négatif de Daxx) (e) le surnageant de lyse cellulaire avec l'anticorps anti-E6 (positif contrôle de HPV16 E6) (f) le complexe attiré par l'anticorps anti-Daxx avec l'anticorps anti-E6 (g) le complexe attiré par l'anticorps anti-E6 avec l'anticorps anti-E6 (h) le complexe attiré par le Anticorps IgG avec anticorps anti-E6 (contrôle négatif de HPV16 E6). B Localisation des HPV16 E6 et Daxx par immunofluorescence indirecte. (a) Cellules C33A avec des anticorps anti-E6 de souris visualisées avec des IgG de chèvre anti-souris conjuguées au TRITC (rouge) (b) Cellules C33A avec des anticorps anti-Daxx de lapin visualisées avec des IgG de chèvre anti-lapin conjuguées au FITC (vert) (c ) Cellules C33A avec colorant ADN (bleu) (d) a et c se chevauchent (e) b et c se chevauchent (f) a et b se chevauchent, montrant une fluorescence jaune (h) a, b et c se chevauchent

La fluorescence bleue a été attribuée au noyau. La fluorescence rouge de HPV16 E6 était distribuée dans le noyau et le cytoplasme. La fluorescence verte de Daxx était principalement dans le noyau. Cependant, dans les cellules exprimant HPV16 E6, la fluorescence verte était également distribuée dans le noyau et le cytoplasme. La superposition des images a révélé la fluorescence jaune (Fig. 1B).

Effets de HPV16 E6 sur l'expression de Daxx

Comme le montre la figure 2A, il n'y avait pas beaucoup de différence statistique dans la quantification relative de l'ARN Daxx entre les groupes négatifs et blancs (p > 0,05), mais il y avait une différence significative entre les groupes Daxx et Négatif, comme prévu (p < 0.01). Il n'y avait pas beaucoup de différence statistique entre les groupes E6 et Négatif (p > 0,05). Cependant, il y a eu une nette diminution de la transfection Daxx unique au groupe de co-transfection, et les différences entre les groupes Daxx+E6 et Daxx étaient statistiquement significatives (p < 0.05). Cela suggère que HPV16 E6 peut avoir une certaine influence sur la fonction de Daxx.

Effets de HPV16 E6 sur l'expression de Daxx. UNE Quantification relative de l'ARN Daxx par PCR quantitative. La quantification relative de Daxx a été évaluée en utilisant la méthode double delta Ct (ΔΔCt). , p < 0.05. B Expression de la protéine Daxx évaluée par western blot. (a) Cellules C33A sans transfection (b) Cellules C33A avec transfection vectorielle vide (c) Cellules C33A avec transfection Daxx (d) Cellules C33A avec co-transfection E6 et Daxx (e) Cellules C33A avec transfection E6. C Valeurs de densité intégrées basées sur les résultats du Western blot. IntDen TP/IR décrit le rapport de la densité intégrée de la référence interne à celle de la protéine cible (IntDen IR/TP). ★ , p < 0.01

Comme le montrent les figures 2B et C, les différences d'expression protéique de Daxx entre les groupes négatifs et blancs (p > 0.05) et les groupes Daxx et Negative (p < 0,01) étaient similaires à ceux de la quantification relative de l'ARN de Daxx, montrant que pCDNA3.1(+)/Daxx a été transfecté avec succès dans des cellules C33A.

Effets du HPV16 E6 sur la prolifération des cellules C33A

Comme le montrent les résultats de la numération cellulaire (Fig. 3a), les différences de nombre total de cellules, de nombre de cellules mortes ou de nombre de cellules viables entre le groupe transfecté par Daxx et le contrôle négatif étaient statistiquement significatives (p < 0.05). Cependant, les différences entre le groupe transfecté HPV16 E6 et le groupe négatif n'étaient pas statistiquement significatives (p > 0,05). De plus, la différence de nombre de cellules viables pour le groupe transfecté Daxx était nettement inférieure à celle du groupe co-transfecté HPV16 E6 et Daxx (p < 0.05).

Effets de HPV16 E6 sur la prolifération cellulaire. une Résultats du comptage des cellules pour tous les groupes. L'unité de comptage des cellules était 106, c'est-à-dire E+ 06. b Ratios d'inhibition de la prolifération pour tous les groupes. Le rapport d'inhibition de la prolifération (PI) représente l'inhibition de la prolifération cellulaire. , p < 0,05 ★ , p < 0.01

Les tests MTT (Fig. 3b) ont montré que la prolifération cellulaire dans le groupe transfecté Daxx était nettement inférieure à celle du groupe témoin négatif (p < 0.01). Le ratio IP du groupe transfecté par Daxx était plus élevé que celui des autres groupes et ces différences étaient également statistiquement significatives (p < 0.01). La différence entre les groupes transfectés HPV16 E6 et négatifs n'était pas statistiquement significative (p > 0,05). Il est important de noter que la différence entre le groupe transfecté par Daxx et le groupe co-transfecté par HPV16 E6 et Daxx n'était pas non plus statistiquement significative (p > 0,05), indiquant que HPV16 E6 peut ne pas être suffisant pour inhiber la régulation négative de Daxx sur la prolifération cellulaire.

Effets du HPV16 E6 sur l'apoptose des cellules C33A

Les cellules apoptotiques ont été observées intuitivement sous un microscope à fluorescence (Fig. 4A). Il était clair que les groupes avec transfection Daxx avaient plus de cellules apoptotiques que les autres groupes. Les changements morphologiques caractéristiques de l'apoptose ont été observés dans les cellules ayant subi un traitement Daxx.

Effet de HPV16 E6 sur l'apoptose des cellules C33A. UNE Observation de cellules apoptotiques représentatives. Les groupes avec transfection Daxx avaient plus de cellules apoptotiques que les autres groupes. (a) Cellules C33A sans transfection (b) Cellules C33A avec transfection vectorielle vide (c) Cellules C33A avec transfection Daxx (d) Cellules C33A avec co-transfection E6 et Daxx (e) Cellules C33A avec transfection E6. B Données de cytométrie en flux représentatives. (a) C33A cells without transfection (b) C33A cells with empty vector transfection (c) C33A cells with Daxx transfection (d) C33A cells with E6 and Daxx co-transfection (e) C33A cells with E6 transfection. C Apoptosis rate. The mean apoptosis rate of each group came from the flow cytometry data. ★ ★ , p < 0.01

As expected, the results of the FCM tests (Fig. 4B and C) showed that there was not much difference between the groups with empty plasmid transfection and non-transfection statistically (p > 0.05). Similarly, the difference between the HPV16 E6-transfected group and the empty plasmid-transfected group was not statistically significant (p > 0.05), indicating that HPV16 E6 had little effect on the apoptosis of C33A cells. There was considerable difference between the groups with Daxx transfection and with empty plasmid transfection (p < 0.01), showing that Daxx transfection caused more apoptosis. However, it was found that there was a significant difference between the Daxx and HPV16 E6 co-transfected group and the Daxx-transfected group (p < 0.01).

Summing up, there was no obvious decrease or increase in apoptosis of C33A cells after HPV16 E6 transfection (p > 0.05). It was also evident that the apoptosis of C33A cells with Daxx and E6 co-transfection was low compared with that of cells with Daxx transfection alone. It is thus unknown whether HPV16 E6 can inhibit or promote cell apoptosis, but it can clearly affect the apoptosis caused by Daxx. This may be related to the interaction of HPV16 E6 and Daxx.

Impact of HPV16 E6 on caspase-8 activity in C33A cells

As shown in Fig. 5, the caspase-8 activity of the Daxx-transfected group was higher than that of the empty plasmid-transfected group, and this difference had statistical significance (p < 0.01). However, there was no difference between the HPV16 E6-transfected group and the negative control group (p > 0.05). Moreover, the caspase-8 activity of the co-transfected group was statistically significantly higher than that of the HPV16 E6-transfected group (p < 0.01). However, the differences between the Daxx-transfected group and co-transfected group were not statistically significant (p > 0.05).

Effects of HPV16 E6 on caspase-8 activity. The A405 value represents the relative activity of caspase-8. ★ ★ , p < 0.01


E6(R2) Good Clinical Practice: Integrated Addendum to ICH E6(R1) March 2018

Good Clinical Practice (GCP) is an international ethical and scientific quality standard for designing, conducting, recording and reporting trials that involve the participation of human subjects. Compliance with this standard provides public assurance that the rights, safety, and well-being of trial subjects are protected, consistent with the principles that have their origin in the Declaration of Helsinki, and that the clinical trial data are credible.

The objective of this ICH GCP guidance is to provide a unified standard for the European Union, Japan, and the United States to facilitate the mutual acceptance of clinical data by the regulatory authorities in these jurisdictions.


Méthodes

Population de patients

Eight adult patients (7 males and 1 female) ranging in age from 51 to 72 years were included in this study. The anatomical locations of their biopsy-proven squamous cell carcinomas included palatine tonsil in five and tongue base in three.

Data collection protocols

Data collection and molecular analyses were performed in accordance with the guidelines of the University of Texas McGovern Medical School Committee for the Protection of Human Subjects Institutional Review Board (IRB).

Molecular analyses

Molecular analyses included in-situ hybridization for the expression of HPV-HR18 E6/E7 mRNA using the RNAscope® technology from Advanced Cell Diagnostics (https://acdbio.com/). Morphoproteomic analysis and biomedical analytics were also performed as part of the molecular analysis in our CLIA and CAP certified Consultative Proteomics Laboratory in order to define the biology of the patients’ tumors, to provide correlative expressions, and to ascertain targeted therapeutic options designed to reduce the progression or recurrence of the HPV-associated oropharyngeal carcinomas.

In-situ hybridization

RNAscope® 2.5HD Red Assay was performed to evaluate expression in all 8 tissue specimens. The test assayed 18 high-risk HPV serotypes: HPV-HR18 HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 and 82, E6/E7 mRNA. Hs-PPIB was used as a positive control marker for sample quality control (QC) and to evaluate RNA quality in all the tissue samples. Bacterial gene dapB was used as a negative control. Standard pretreatment assay conditions were determined to be optimal for the samples in the study set. All the samples in the study passed QC with strong PPIB expression and no/negligible dapB background. A semi-quantitative scoring system of 0-4 was utilized.

Morphoproteomics

Morphoproteomic analysis applies bright field microscopy and immunohistochemistry directed against various protein analytes to define the biology of a neoplastic process. The analysis uncovers etiopathogenetic occurrences that might be responsible for the process development and the propensity for it to recur [5, 6]. Immunohistochemical probes were applied against the following protein analytes in unstained sections of the patients’ oropharyngeal carcinomas: Ki-67 (G1, S, G2 and M phases of the cell cycle DakoCytomation, Carpinteria, California, lot #20001030) and enhancer of zeste homolog 2 (EZH2 Cell Signaling Technology, Inc., lot #7). The level of expression of the analytes was graded on a 0 to 3+ scale based on signal intensity indicated by a 3,3′- tetrahydrochloride (DAB) chromogenic (brown) signal, the nuclear estimation of Ki-67 and EZH2 percentages, and mitotic index based on mitotic figures/10 high power fields. The details of the morphoproteomic staining procedure have been previously described [5, 6].

Biomedical analytics

To gain insights into HPV-associated oropharyngeal carcinoma, a standard IPA oropharyngeal pathway network (“ORO”) was constructed from key molecules associated with oropharyngeal carcinoma in the Ingenuity Knowledge Base (www.ingenuity.com). Since IPA does not include viral species, E6/E7 and their interactions associated with HPV (hsa05203) (“HPV” network) were extracted from the KEGG pathway database (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) and manually added to the ORO network. A “patient” pathway network was also constructed from the median patient scores and linked to ORO-HPV. From these graphs and additional data mining of the National Library of Medicine’s MEDLINE database, a single ORO-HPV network model was constructed using IPA Pathway Designer to represent the key modulation and adaptive responses in the signal transduction processes. Therapies were then linked to the ORO-HPV network model to assess potential benefits.

Results

The IHC workup had established the expression of p16INK4a protein in all cases (Fig. 1, Table 1).

Patient 8 biopsy specimen with non-keratinizing oropharyngeal carcinoma compared with concurrent non-neoplastic mucosa. H&E and p16INK4a stained sections of non-keratininzing squamous cell carcinoma versus non-neoplastic squamous epithelium (Frames une et c et b et , respectively note strong DAB brown chromogenic signal for p16INK4a in oropharyngeal carcinoma [Frame c] versus absence of expression in non-neoplastic squamous mucosa [Frame ] original magnification ×200 Frames une-)

In-situ hybridization

HPV-HR18 E6/E7 was detected at high levels across most samples (score 4) with the exception of patient specimens 5 and 6 that scored at 2 and 3, respectively (see Table 2 and Fig. 2).

Patient 8 biopsy specimen with non-keratinizing oropharyngeal carcinoma compared with adjacent non-neoplastic mucosa. rouge RNAscope® 2.5 HD in-situ hybridization (ISH) assay for HPV-HR18 E6/E7 mRNA performed on the non-keratinizing squamous cell carcinoma revealed strong red chromogenic cytoplasmic expression (4+ semi-quantitative score, see Table 2) in the tumor (lower right and middle, Frame une) and no expression in the adjacent non-neoplastic (upper left, Frame une). Contrast with the dapβ negative control in Frame b. (original magnification ×200 for Frames a and b)

Morphoproteomics

Nuclear expressions of EZH2 (enhancer of zeste homolog 2) and Ki-67 (G1, S, G2 and M phases of the cell cycle) and mitotic indices (mitotic figures/10 high power fields) by visual estimation on each case revealed a median of 90% and 70% for EZH2 and Ki-67, respectively and a range of 16 to 105 for the mitotic indices (Table 1 and Fig. 3, frames a and b, c and d, and e and f, respectively for EZH2, Ki-67 expression, and mitotic progression).

Patient 8 biopsy specimen with non-keratinizing oropharyngeal carcinoma compared with concurrent non-neoplastic mucosa. Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) and Ki-67 (G1, S, G2 and M phases of the cell cycle) show strong (3+ on a scale of 0-3+) nuclear expression in a majority of the non-keratinizing squamous cell carcinoma (NKSCC) versus similar expression primarily limited to the basal and suprabasal cells of the non-neoplastic squamous mucosa (Frames une et c contre b et , respectivement). Mitotic progression in the corresponding H&E coincides with the EZH2 and Ki-67 expression with multiple mitotic figures evident in the NKSCC (Frame e) with no mitotic figures in the adjacent non-neoplastic squamous mucosa (Frame F). (DAB brown chromogenic signal for frames une- original magnifications ×200 for frames une- and ×400 for Frames e et F)

Biomedical analytics

In order to provide a visual comparison, biomedical analytics generated a normalized score by patient of the comparative analytes for Ki67, mitotic index, p16INK4a, EZH2 and E6/E7 mRNA. This is illustrated in the bar chart (Fig. 4).

Bar chart of normalized (median) score by patient of the comparative analytes for Ki67, mitotic index, p16INK4a,EZH2 and E6/E7 mRNA. Comparison of normalized scores. Note that patient #5 has the lowest E6/E7 score (assessed as moderate, 2+), and also the lowest mitotic index (see Tables 1 and 2)

ORO-HPV network model

There were extensive crossover interactions between the HPV pathway and the ORO pathway. Three molecules of interest - EZH2, MKI67 (Ki67) and CDKN2A (p16 INK4a) were present – and affected – in the combined pathway network (not shown.) This combined ORO-HPV network model contained 1086 molecular interactions, or links, in the 3 linked pathways of ORO, HPV, and median patient. Of the 1086 links, 513 bridged between the ORO network and the HPV network. For the patient, the level of CDKN2A affected more molecules associated with HPV than with ORO. In return, more molecules from HPV than ORO affected the patient network, with TP53 and RB1 being the major influencers. 174 molecules from ORO affected HPV and patients whereas 224 molecules from HPV affected ORO and patient.

Therapeutic interactions

The complex ORO-HPV network model was edited to focus on the key molecules: E6/E7 mRNA, EZH2, Ki-67 (MK167) plus related interactions from the National Library of Medicine’s MEDLINE Database. The potential efficacy of sulforaphane and the metformin and curcumin therapies – the latter in part through the upregulation of microRNAs – were graphically demonstrated (Fig. 5). EZH2 was identified as a possible therapeutic target. It can be seen from the networks that EZH2 (Fig. 5, upper left) is a key network point that is activated by E6/E7. Mir-26A can be seen in the upper right hand corner of Fig. 5 it needs to be upregulated to decrease EZH2.

Potential therapies for ORO-HPV combined pathway. Celecoxib, curcumin, metformin, sulforaphane (right, yellow). Scored molecules: CDKN2A, EZH2, MKI67 (left, light orange). E6, E7 (lower right, blue, viral †). microRNAs: miR-26a, MIR101, miR-101 (top, pink)


Create an external reference between cells in different workbooks

Open the workbook that will contain the external reference (the destination workbook, also called the formula workbook) and the workbook that contains the data that you want to link to (the source workbook, also called the data workbook).

In the source workbook, select the cell or cells you want to link.

presse Ctrl+C or go to Accueil > Clipboard > Copy.

Switch to the destination workbook, and then click the worksheet where you want the linked data to be placed.

Select the cell where you want to place the linked data, then go to Accueil > Clipboard > Paste > Paste Link.

Excel will return the data you copied from the source workbook. If you change it, it will automatically change in the destination workbook when you refresh your browser window.

To use the link in a formula, type = in front of the link, choose a function, type (, and then type ) after the link.


Human Papillomavirus Type 16 Variant Analysis of E6, E7, and L1 Genes and Long Control Region in Biopsy Samples from Cervical Cancer Patients in North India

FIGUE. 1 . Sequencing electropherogram showing frequently detected nucleotide variations in different genomic segments of HPV-16. (a) E6 T350G (b) E7 T789C (c) L1 A6695C and (d) LCR G7521A. The upper panel shows prototype sequences, while the lower panel shows variant sequences (indicated by arrows). FIGUE. 2 . Nucleotide sequence variations among the HPV-16 isolates. The nucleotide positions of E6, E7, the LCR, and L1 at which variations were observed are written across the top. The identification codes of the samples are indicated on the left. REF, the HPV-16 reference DNA sequence. For each variant sequence, positions that do not vary from those of the HPV reference sequence are marked with dashes.

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Voir la vidéo: LE LIVRE POUR RÉUSSIR EN BIOLOGIE!?! (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Ahuiliztli

    Vous autorisez l'erreur. Écrivez-moi dans PM, nous parlerons.

  2. Goltile

    Désolé d'intervenir, mais j'ai besoin d'un peu plus d'informations.

  3. Faegan

    Rappelez-vous une fois pour toutes!

  4. Stanwick

    Oui en effet. Je suis d'accord avec tout ce qui précède. Discutons de cette question. Ici ou à PM.



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