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Traitement PEG-silane : pourquoi incuber 18 heures à 60 degrés Celsius ?

Traitement PEG-silane : pourquoi incuber 18 heures à 60 degrés Celsius ?


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Je mène une expérience liée à la biochimie et j'ai été incapable de comprendre une étape qui est couramment effectuée. Mon objectif dans cette étape est d'appliquer une couche de silane de PEG (Polyéthylène glycol).

Après immersion des lames d'oxyde d'indium et d'étain (ITO) dans une concentration de PEG, les lames sont incubées pendant 18 heures à une température de 60 degrés Celsius.

Pouvez-vous me dire pourquoi l'incubation est effectuée? Et pourquoi pendant 18 heures et à 60 degrés Celsius ?

Merci beaucoup d'avance!!


La liaison des protéines (et des cellules) aux surfaces en verre (ou en silicium) peut être évitée en enduisant le verre de groupes polyéthylène glycol (PEG). Le PEG-silane est un réactif utilisé pour créer ce revêtement.

Le PEG-silane (l'image montre une version méthoxy) (image prise à partir d'ici ; pas de connexion) recouvrira les surfaces de verre car la partie silane (extrémité droite de la structure illustrée) réagira avec les groupes -OH sur la surface du verre.

Je ne peux pas aider avec la partie de la question sur le temps et la température d'incubation, mais cela semble plus long et plus chaud que les protocoles que j'ai vus. Peut-être que le revêtement d'oxyde d'indium et d'étain (ITO) sur les diapositives y est pour quelque chose ?


veuillez consulter le journal : S. Jo, K. Park, Biomaterials 21 (2000) 605-616. Le temps et la température contribuent probablement à l'hydrolyse, à la formation de liaisons hydrogène et à la formation de liaisons covalentes. J'espère que ce papier vous aidera. Bonne chance!


Bactéries coliformes ?

Aussi communément appelés « organismes indicateurs », les coliformes désignent une grande variété de bactéries que l'on peut trouver dans l'environnement. Cela signifie que ces organismes peuvent être trouvés dans le sol, les surfaces d'eau, les végétations ainsi que sur la peau ou le tractus intestinal d'organismes à sang chaud tels que les humains.

Bien que certains soient pathogènes (capables de provoquer des maladies - maladies bénignes à mortelles), la plupart d'entre eux sont inoffensifs. Quoi qu'il en soit, la détection de coliformes (organismes indicateurs) indique la présence de bactéries potentiellement pathogènes non seulement dans l'eau, mais également dans des aliments et des boissons donnés (lait, etc.). Par conséquent, les coliformes sont importants car ils aident à sensibiliser et à déterminer la source de la bactérie.


Principe

L'eau à tester est diluée en série et inoculée dans un bouillon lactose, les coliformes s'ils sont présents dans l'eau utilisent le lactose présent dans le milieu pour produire de l'acide et du gaz. La présence d'acide est indiquée par le changement de couleur du milieu et la présence de gaz est détectée sous forme de bulles de gaz recueillies dans le tube de Durham inversé présent dans le milieu. Le nombre de coliformes totaux est déterminé en comptant le nombre de tubes donnant une réaction positive (c'est-à-dire à la fois le changement de couleur et la production de gaz) et en comparant le modèle de résultats positifs (le nombre de tubes montrant une croissance à chaque dilution) avec des tableaux statistiques standards.


Traitement PEG-silane : pourquoi incuber 18 heures à 60 degrés Celsius ? - La biologie

Par Brian Pumphrey New Brunswick Scientific (UK) Ltd et Christian Julien New Brunswick Scientific Benelux BV (Pays-Bas) Mai 1996


La fermentation est le terme utilisé par les microbiologistes pour décrire tout processus de production d'un produit au moyen de la culture de masse d'un micro-organisme.

Les produit peut être soit :
1. La cellule elle-même : appelée production de biomasse.
2. Un métabolite propre à un micro-organisme : appelé produit d'une souche naturelle ou génétiquement améliorée. Voir le tableau 1.
3. Un produit étranger de micro-organismes : appelé produit issu de la technologie de l'ADN recombinant ou d'une souche génétiquement modifiée, c'est-à-dire une souche recombinante. Voir le tableau 2.


2.1. Classification des micro-organismes
Le royaume Protista comprend des organismes unicellulaires capables de s'auto-dupliquer ou de diriger leur propre réplication. Les procaryotes ne possèdent pas de véritable noyau ni de membrane nucléaire, alors que les eucaryotes ont un noyau enfermé dans une membrane nucléaire distincte. Les protistes non cellulaires ne subissent pas d'auto-réplication, mais dirigent leur reproduction dans une autre cellule appelée hôte.

Les cyanobactéries (algues bleu-vert) de la figure 1 ont été classées comme un groupe distinct de micro-organismes, bien qu'elles soient fréquemment considérées comme faisant partie d'autres bactéries. Les champignons peuvent être subdivisés en champignons inférieurs ainsi qu'en moisissures visqueuses et en champignons supérieurs qui comprennent des levures. Les levures sont des cellules uniques et libres, contrairement aux champignons, auxquels elles ressemblent beaucoup. Les protozoaires sont de minuscules organismes vivants libres qui, bien qu'ils ne soient généralement pas utilisés pour les processus biotechnologiques, ont été inclus par souci d'exhaustivité. Les myxomycota, communément appelés moisissures visqueuses (ou champignons visqueux) sont des fluides à larges contraintes. Les chicanes produisent une grande surface de liquide plane et un modèle d'écoulement uniforme ainsi qu'augmentent la rétention de liquide pour un volume de fermenteur donné.

Les substances tensioactives telles que agents antimousse réduire le taux de transfert d'oxygène. Dans l'eau pure, la surface de la bulle est constamment renouvelée par vibration et oscillation. Dès que des substances tensioactives sont ajoutées, le renouvellement de la surface de la bulle par le mouvement des bulles cesse.

Les micro-organismes eux-mêmes ont un effet sur le taux de transfert d'oxygène en agissant comme une barrière, inhibant ainsi l'O2 transfert. Avec les microorganismes filamenteux, il existe des variations selon que le mycélium est en vrac ou en pastilles. Alors que le taux de transfert d'oxygène diminue progressivement à mesure que la taille des pastilles augmente, il y a un déclin beaucoup plus prononcé avec les formes lâches.

Les bulles de gaz sont reconstituées dans des emplacements du bioréacteur où il y a une pression négative, comme derrière les pales de l'agitateur. Au fur et à mesure que le taux d'aération augmente, diverses conditions peuvent être caractérisées. À de faibles taux d'aération, de grosses bulles de gaz se forment derrière les aubes de turbine individuelles et des bulles plus petites sont filées par centrifugation dans la solution nutritive. Au fur et à mesure que le taux d'aération augmente, des bulles de gaz s'accumulent derrière toutes les aubes de turbine et continuent de s'accumuler. L'apport d'énergie est inférieur d'un tiers à celui utilisé dans les systèmes non aérés. Dans cette plage d'agitation intermédiaire, la dispersion gazeuse est la meilleure. À des taux d'aération très élevés, de nombreuses grosses bulles de gaz adhèrent les unes aux autres et la turbine est inondée de gaz, ce qui réduit considérablement la dispersion du gaz.

Les concentration critique en oxygène est le terme utilisé pour indiquer la valeur de la taux d'absorption d'oxygène ou otaux d'absorption d'oxygène qui permet de respirer sans entrave. En général, les concentrations critiques en oxygène sont de 5 à 25 % de la valeur de saturation en oxygène dans les cultures. À des taux d'absorption d'oxygène inférieurs aux concentrations critiques, le taux de respiration est corrélé à l'O2 concentration dans la solution. Au-dessus de cette valeur, aucune dépendance entre la fréquence respiratoire et l'oxygène dissous n'a été observée. Dans les fluides newtoniens, tels que ceux qui se produisent dans les levures et les fermentations bactériennes, la concentration critique en oxygène est constante et n'est pas affectée par les conditions de fermentation. Dans les solutions non newtoniennes, telles que celles qui se produisent avec des micro-organismes filamenteux, il a été démontré que la concentration critique en oxygène dépend des conditions de fermentation.


2.5.3. Production de chaleur
Afin d'obtenir des rendements optimaux, les fermentations doivent être effectuées à Température constante. Nous discutons maintenant des paramètres affectant le bilan thermique d'un processus de fermentation.

La vitesse de production de chaleur due à l'agitation, au gazage/à l'aération et à l'activité métabolique des micro-organismes doit être compensée par la perte de chaleur résultant de l'évaporation et du rayonnement plus l'élimination de la chaleur par le système de refroidissement.

Au cours du métabolisme, le dégagement de chaleur est une conséquence de la thermodynamique de l'activité microbienne globale. En dehors de la digestion anaérobie et de certaines autres activités microbiennes thermophiles, la quantité de chaleur produite est généralement si élevée que si elle n'est pas éliminée, elle élève la température du contenu du fermenteur à un niveau au-delà de la plage optimale pour le système.

L'évolution de la chaleur au cours de l'activité métabolique est liée à l'utilisation du carbone et de la source d'énergie. Lorsque la source de carbone est activement incorporée dans la biomasse à travers l'anabolisme pendant la croissance, environ 40 à 50 % de l'enthalpie disponible dans le substrat est conservée dans la biomasse, le reste étant dégagé sous forme de chaleur. Lorsque la source de carbone est catabolisée pour fournir de l'énergie pour l'entretien des cellules, toute l'enthalpie associée à l'oxydation du substrat est libérée sous forme de chaleur. Si un produit biochimique se forme, la chaleur dégagée se situe entre la chaleur dégagée lors de la maintenance et celle dégagée lors de la croissance active. La quantité de chaleur dégagée est liée à la stoechiométrie pour la croissance et la formation du produit, tandis que le taux de dégagement de chaleur est lié au taux d'activité microbienne.


2.6. Stérilisation
cultures à tous les stades, de la culture préliminaire au fermenteur. Un fermenteur peut être stérilisé soit en détruisant les micro-organismes avec un agent mortel tel que la chaleur, les radiations ou un produit chimique, soit en éliminant les micro-organismes viables par une procédure physique telle que la filtration.

Pendant la fermentation, les points suivants doivent être respectés pour assurer la stérilité :
stérilité des milieux de culture
stérilité de l'air entrant et sortant
construction appropriée du bioréacteur pour la stérilisation et pour la prévention de la contamination pendant la fermentation

STÉRILISATION DES MILIEUX DE CULTURE
Les milieux nutritifs tels qu'ils sont initialement préparés contiennent une variété de cellules végétatives et de spores différentes, dérivées des constituants du milieu de culture, de l'eau et du récipient. Ceux-ci doivent être éliminés par un moyen approprié avant l'inoculation. Un certain nombre de moyens sont disponibles pour la stérilisation, mais en pratique la chaleur est le mécanisme le plus souvent utilisé.

Un certain nombre de facteurs influencent le succès de la stérilisation thermique : le nombre et le type de micro-organismes présents, la composition du milieu de culture, la valeur du pH et la taille des particules en suspension. Les cellules végétatives sont rapidement éliminées à des températures relativement basses telles que 60 degrés Celsius pendant 5 à 10 minutes, mais pour la destruction des spores, des températures de 121 degrés Celsius sont nécessaires pendant 15 minutes.

Lors de la stérilisation thermique, il y a toujours la possibilité de détruire des ingrédients dans le milieu. Outre la dégradation des composants thermolabiles, contribue également à la perte de la qualité des nutriments lors de la stérilisation. Un phénomène courant est l'apparition de réactions de brunissement de type Maillard qui provoquent une décoloration du milieu ainsi qu'une perte de qualité nutritive. Ces réactions sont normalement causées par des groupes carbonyle, généralement issus de sucres réducteurs, interagissant avec des groupes amino provenant d'acides aminés et de protéines. Une stérilisation séparée du composant glucidique du milieu peut être nécessaire pour empêcher de telles réactions.

La stérilisation par filtre est souvent utilisée pour tous les composants des solutions nutritives qui sont sensibles à la chaleur. Les sucres, les vitamines, les antibiotiques ou les composants sanguins sont des exemples de composants thermolabiles qui doivent être stérilisés par filtration.

La plupart des milieux nutritifs sont actuellement stérilisés par lots dans le bioréacteur à 121 degrés Celsius. Des temps de stérilisation approximatifs peuvent être calculés à partir de la nature du milieu et de la taille du fermenteur. Non seulement les milieux nutritifs, mais aussi les raccords, les vannes et les électrodes du fermenteur lui-même doivent être stérilisés. Par conséquent, les temps de stérilisation réels sont nettement plus longs que ceux calculés et doivent être déterminés empiriquement pour les solutions nutritives spécifiques dans le fermenteur. Les fermenteurs plus petits sont stérilisés dans un autoclave tandis que les fermenteurs plus grands sont stérilisés par injection de vapeur indirecte ou directe.

STÉRILISATION DE L'AIR DE FERMENTATION
La plupart des fermentations sont opérées sous haute aération et l'air fourni au fermenteur doit être stérilisé. Le nombre de particules et de micro-organismes dans l'air varie considérablement en fonction de l'emplacement, du mouvement de l'air et du traitement antérieur de l'air . En moyenne, l'air extérieur contient 10 à 100 000 particules par m 3 et 5 à 2 000 micro-organismes par m 3 . Parmi ceux-ci, 50 % sont des spores de champignons et 40 % sont des bactéries à Gram négatif.

Les fermenteurs fonctionnent généralement avec des taux d'aération de 0,5-2 vvm (volume d'air/volume de liquide par minute). Les méthodes disponibles pour stériliser les gaz comprennent la filtration, l'injection de gaz (ozone), l'épuration des gaz, le rayonnement (UV) et la chaleur. Parmi ceux-ci, seules la filtration et la chaleur sont pratiques.

CONSTRUCTION APPROPRIÉE DU FERMENTEUR
Il doit y avoir un nombre minimum d'ouvertures dans le fermenteur pour favoriser le maintien de la stérilité. Les petites ouvertures doivent être rendues étanches avec des joints toriques, les grandes ouvertures avec des joints plats. Chaque fois qu'un arbre mobile pénètre dans la paroi du fermenteur, des problèmes particuliers de maintien de la stérilité doivent être résolus.


2.7. Processus de fermentation
Un schéma global d'un processus de fermentation peut être décrit comme suit :
* Étape 1 : conservation de l'inoculum
* Étape 2 : accumulation d'inoculum
* Étape 3 : culture en fermenteur

ÉTAPE 1 : CONSERVATION DE L'INOCULUM
L'objectif de la conservation est de maintenir les souches le plus longtemps possible sans division cellulaire. La méthode optimale de conservation doit être élaborée pour chaque souche. Les trois techniques suivantes sont les plus couramment utilisées :
* Stockage à basse température (2-6 degrés Celsius)
* Stockage congelé (-18, -80 ou -196 degrés Celsius)
* Lyophilisation

Le stockage à 2-6 degrés Celsius est le moins sûr, il existe un risque relativement élevé de contamination et de mutation inverse en cas de transfert fréquent. Le stockage congelé est le plus courant et les cultures congelées peuvent se conserver plusieurs années. La proportion de survivants est critique car jusqu'à 95 % des micro-organismes sont généralement tués pendant la congélation et la décongélation ultérieure. La meilleure méthode de conservation des souches est la lyophilisation (lyophilisation).

ÉTAPE 2 : CROISSANCE DE L'INOCULUM
La culture conservée est initialement relancée par croissance dans un erlenmeyer sur un agitateur biologique ou sur un milieu solide (si la formation de spores est nécessaire). Afin d'obtenir un inoculum suffisant pour les petits fermenteurs, une deuxième série de cultures sous agitation est généralement réalisée dans plusieurs flacons. À partir de souches lyophilisées, la croissance de l'inoculum prend environ 4 à 10 jours, à partir de cultures congelées, la croissance de l'inoculum prend de 4 à 48 heures pour les bactéries et de 1 à 7 jours pour les champignons. Enfin, hors des cultures réfrigérées, la croissance de l'inoculum prend 4 à 24 heures pour les bactéries et 1 à 5 jours pour les champignons.

ÉTAPE 3 : CULTURE FERMENTEUR
Les milieux nutritifs pour la production doivent être optimisés non seulement dans les ingrédients utilisés mais aussi dans la façon dont le milieu est préparé et stérilisé, la valeur du pH avant et après la stérilisation. Les paramètres les plus importants pendant la fermentation sont :
* Température
* Aération
* Remuer


2.8. La gestion des processus
La gestion des processus concerne :
* Mise en place des conditions initiales du processus
* Suivi pour vérifier si le processus suit le cours requis
* Faciliter les ajustements manuels des variables de processus
* Décider quand mettre fin au processus et/ou transférer ou récolter le produit
* Calcul des bilans massiques et thermiques, vitesses de réaction, cinétiques et rendements (voir tableau 4)
* Fournir des informations pour les enregistrements statistiques sur la cohérence et à des fins d'archivage
* Surveillance de la contamination et de l'hygiène des procédés

Étant donné que de nombreux bioprocédés, en particulier ceux impliquant la fermentation, sont exploités par lots, ils représentent des problèmes de valeur initiale. par conséquent mesure de processus est concerné par la mise en place de l'opération de manière précise et reproductible. Contrôle de processus vise à apporter des ajustements au processus à la suite de la mesure d'une ou plusieurs des variables qui changent à la suite de l'action du processus. Il s'agit de mesurer les variables dépendantes comme indiqué dans le tableau 5.

D'autres paramètres chimiques d'intérêt sont concentration du substrat et concentration du produit. Ces paramètres doivent être analysés hors ligne en laboratoire.

Les paramètres biologiques d'intérêt comme temps de doublement, nombre total de cellules, viabilité cellulaire, vitalité cellulaire et masse cellulaire poids sec doivent tous être mesurés à l'extérieur du fermenteur.


ment utilisés comme organismes de recherche. Les virus peuvent être considérés comme des parasites intracellulaires.

Les critères utilisés pour la classification des micro-organismes comprennent la morphologie, les mécanismes de reproduction, la présence de pigments, les moyens de motilité, la physiologie et les caractéristiques structurelles.


2.2. Activité microbienne

Les micro-organismes en cours d'auto-réplication produisent de nombreuses macromolécules complexes à partir d'environ 100 unités monomères différentes. Dans les voies biochimiques pour y parvenir, une cellule bactérienne utilise bien plus de 1000 enzymes différentes et une cellule eucaryote peut en utiliser deux fois plus.

Le métabolisme biochimique peut être divisé en deux grandes classes : le anabolisant voies (anabolisme) synthétisent les molécules complexes et leurs précurseurs intermédiaires, et la catabolique voies (catabolisme) fournissent l'énergie nécessaire aux processus anaboliques. Ces deux activités divergentes sont étroitement liées.

Les micro-organismes qui effectuent leur métabolisme à l'aide d'oxygène sont appelés aérobique micro-organismes. Certains micro-organismes peuvent remplacer l'oxygène par le nitrate, d'autres le sulfate ou l'ion ferrique et ainsi se développer en l'absence d'oxygène. Ces micro-organismes sont appelés anaérobie.

Les micro-organismes peuvent être classés en fonction des températures les plus basses auxquelles une croissance significative se produit. Voir le tableau 3


La croissance de la levure est optimale dans la région de 20-30C pour les espèces mésophiles.

En général, un déplacement de la température d'incubation de la température optimale à une température plus basse entraîne une réduction de l'activité métabolique dépendante de la température. Une augmentation de la température d'incubation peut entraîner une réduction à la fois de la concentration de biomasse et de la viabilité cellulaire en raison d'une diminution de l'activité enzymatique dépendante de la température et de l'exposition.

De nombreux micro-organismes affichent un pH optimal pour la croissance aux alentours de 7, la majorité privilégiant la plage de pH 5-8. Cependant, il existe des exceptions, notamment les bactéries de l'acide acétique, les thiobacilles et les bactéries de décomposition de l'urée. De plus, de nombreuses algues vivent dans les eaux naturelles dont le pH est supérieur à 10.


2.3. Cinétique microbienne
FERMENTATION EN LOTS

UNE fermentation discontinue peut être considéré comme un système fermé. Au temps t=0, la solution nutritive stérilisée dans le fermenteur est inoculé avec des micro-organismes et l'incubation est autorisée. Au cours de toute la fermentation, rien n'est ajouté, à l'exception de l'oxygène (en cas de micro-organismes aérobies), un agent anti-mousse, et un acide ou une base pour contrôler le pH. La composition du milieu de culture, la concentration en biomasse et la concentration en métabolites changent généralement constamment en raison du métabolisme des cellules.

Après l'inoculation d'une solution nutritive stérile avec des micro-organismes et la culture dans des conditions physiologiques, quatre phases typiques de croissance sont observées comme indiqué sur la Fig.2.

Phase de latence
Équilibrage physico-chimique entre le micro-organisme et l'environnement après inoculation avec très peu de croissance.

Phase de journalisation
A la fin de la phase de latence, les cellules se sont adaptées aux nouvelles conditions de croissance. La croissance de la masse cellulaire peut maintenant être décrite quantitativement comme un doublement du nombre de cellules par unité de temps pour les bactéries et les levures, ou un doublement de la biomasse par unité de temps pour les organismes filamenteux comme les champignons. En traçant le nombre de cellules ou de biomasse en fonction du temps sur un graphique semi-logarithmique, une ligne droite en résulte, d'où le terme log phase. Bien que les cellules modifient le milieu par absorption de substrats et excrétion de produits métaboliques, le taux de croissance reste constant pendant la phase logarithmique. Le taux de croissance est indépendant de la concentration du substrat tant qu'un excès de substrat est présent.

État stationnaire
Dès que le substrat est métabolisé ou que des substances toxiques se sont formées, la croissance ralentit ou s'arrête complètement. La biomasse n'augmente que progressivement ou reste constante pendant cette phase stationnaire, bien que la composition des cellules puisse changer. En raison de la lyse, de nouveaux substrats sont libérés qui peuvent alors servir de sources d'énergie pour la croissance lente des survivants. Les différents métabolites formés dans la phase stationnaire sont souvent d'un grand intérêt biotechnologique.

Phase de mort
Dans cette phase, les réserves d'énergie des cellules sont épuisées. Une ligne droite peut être obtenue lorsqu'un graphique semi-logarithmique est constitué des survivants en fonction du temps, indiquant que les cellules meurent à un rythme exponentiel. La durée entre la phase stationnaire et la phase de mort dépend du micro-organisme et du procédé utilisé. La fermentation est généralement interrompue à la fin de la phase de bûche ou avant le début de la phase de mort.

FERMENTATION EN LOT FED
Dans le procédé discontinu classique qui vient d'être décrit, tout le substrat est ajouté au début de la fermentation. Une amélioration du processus par lots fermés est la fedbatch fermentation. Dans le processus fed-batch, le substrat est ajouté par incréments au fur et à mesure que la fermentation progresse. Dans la méthode fed-batch, les éléments critiques de la solution nutritive sont ajoutés en petites concentrations au début de la fermentation et ces substances continuent à être ajoutées en petites doses pendant la phase de production.

FERMENTATION CONTINUE
Dans fermentation continue, un système ouvert est mis en place. Une solution nutritive stérile est ajoutée au bioréacteur en continu et une quantité équivalente de solution nutritive convertie avec des micro-organismes est simultanément retirée du système. Dans le cas d'un bioréacteur à mélange homogène, nous nous référons à un chémostat ou un turbidistat. Dans le chémostat à l'état d'équilibre, la croissance cellulaire est contrôlée en ajustant la concentration d'un substrat. Dans le turbidistat, la croissance cellulaire est maintenue constante en utilisant la turbidité pour surveiller la concentration de biomasse et le taux d'alimentation en solution nutritive est ajusté de manière appropriée.


2.4. Besoins en nutriments

Tous les micro-organismes ont besoin pour leur activité microbienne de la présence de plusieurs nutriments.

Les glucides
Les glucides sont susceptibles d'être utilisés par tous les micro-organismes, bien qu'en aucun cas il n'y ait une exigence absolue pour ce groupe de composés organiques. Le glucose est le sucre le plus facilement métabolisé. La plupart des champignons peuvent utiliser des disaccharides.

Lipides
Les besoins microbiens en stéroïdes et en acides gras à longue chaîne peuvent être résumés comme suit. Les acides gras à longue chaîne comme l'acide linoléique et l'acide oléique sont nécessaires aux bactéries et aux champignons. En général, les stéroïdes, autres que le cholestérol, ne sont pas requis ou utilisés par les micro-organismes. Chez tous les champignons, y compris les levures, l'ergostérol est un besoin nutritionnel.

Purines et pyrimidines
Ce n'est généralement que chez les bactéries que des cas de métabolisme des purines et des pyrimidines ont été rapportés. Les algues n'utilisent pas du tout ces composés.

Vitamines et facteurs de croissance
Il existe une variation considérable entre les espèces dans les besoins en vitamines et en facteurs connexes par d'autres micro-organismes. Généralement, les vitamines A, C, D et K ne sont pas nécessaires à la croissance.

Acides aminés
Les acides aminés ne sont généralement pas requis par les algues, bien que plusieurs espèces d'algues soient capables de les utiliser. Les espèces d'autres micro-organismes sont capables d'utiliser tous les acides aminés, à l'exception des levures, où il n'y a aucune preuve d'utilisation de critrulline. C'est généralement la forme L des acides qui sont biologiquement actifs mais, contrairement aux animaux supérieurs, certaines bactéries peuvent également utiliser les acides aminés D.

Sources d'azote
Il convient de souligner que toutes les espèces n'ont pas besoin ou n'utilisent pas ces composés, mais plutôt que certaines espèces ont été identifiées qui sont capables d'utiliser ces composés. Les champignons ont besoin d'ammoniac, de nitrate et de nitrite.

Sources de soufre
Certaines espèces de levures peuvent utiliser du soufre et du sulfate élémentaires. En général, les levures ne nécessitent ni n'utilisent de composés organiques contenant du soufre. Les bactéries ont besoin de glutathion et d'acide thio-acétique tandis que les levures ont besoin d'amides d'acide sulfonique, de thioacétate, de thiocarbonate, de thioglycolate et de glutathion.

Éléments chimiques et ions inorganiques
Les nutriments minéraux requis par les micro-organismes dépendent des espèces mais se composent généralement de Fe, K, Mg, Mn. Parfois, S, N, Ca, Co, Cu, P, Zn est requis.


2.5. Systèmes de fermentation

Une fermentation microbienne peut être considérée comme une système triphasé, impliquant des réactions liquide-solide, gaz-solide et gaz-liquide.

Les phase liquide contient des nutriments dissous, des substrats dissous et des métabolites dissous.

Les phase solide se compose de cellules individuelles, de pastilles, de substrats insolubles ou de produits métaboliques précipités.

Les phase gazeuse fournit un réservoir pour l'approvisionnement en oxygène et pour le CO2 suppression.


2.5.1. Agiter et mélanger
Le transfert d'énergie, de nutriments, de substrat et de métabolite au sein du bioréacteur doit être réalisé par un dispositif de mélange approprié. L'efficacité de n'importe quel nutriment peut être cruciale pour l'efficacité de toute la fermentation.

Pour les trois phases, l'agitation d'un bioréacteur entraîne :
Dispersion de l'air dans la solution nutritive
Homogénéisation pour égaliser la température et la concentration des nutriments dans tout le fermenteur
Suspension de micro-organismes et de nutriments solides
Dispersion de liquides non miscibles

0,5 m/s. Les solutions nutritives peuvent être subdivisées en deux groupes selon la façon dont elles se comportent lorsqu'elles sont agitées : visqueux solutions avec des propriétés newtoniennes et non newtoniennes et viscoélastique solutions, dans lesquelles les propriétés normales à l'état liquide ne sont pas observées dans les récipients agités. Les viscosité, la capacité d'un matériau à résister à la déformation, est la propriété la plus importante affectant le comportement d'écoulement d'un fluide. Un tel comportement a un effet de marché sur le pompage, le mélange, le transfert de chaleur, le transfert de masse et l'aération.

Il n'y a que quelques exemples qui entrent dans le deuxième groupe, par ex. polysaccharides et certaines fermentations antibiotiques. La plupart des solutions de fermentation entrent dans la première catégorie. Les solutions non ensemencées et les cultures bactériennes se comportent souvent comme de simples liquides newtoniens.

Avec de nombreux organismes mycéliens, des changements se produisent pendant la fermentation non seulement dans la quantité de mycélium, mais dans les caractéristiques de la solution nutritive. Les substrats sont absorbés pendant le métabolisme et la proportion de substrats non dissous est réduite. En même temps, des métabolites sont excrétés, affectant ainsi la viscosité de la solution.


2.5.2. Échange de gaz et transfert de masse
L'un des facteurs les plus critiques dans le fonctionnement d'un fermenteur est la fourniture d'un échange gazeux adéquat. Oxygène est le substrat gazeux le plus important pour le métabolisme microbien, et gaz carbonique est le produit métabolique gazeux le plus important.

Lorsque l'oxygène est requis comme substrat microbien, il est fréquemment un facteur limitant dans la fermentation. En raison de sa faible solubilité, seulement 0,3 mM O2, équivalent à 9 mg/l, se dissout dans un litre d'eau à 20 degrés Celsius dans un mélange air/eau. Cette quantité d'oxygène sera épuisée en quelques secondes par une population microbienne active et concentrée à moins que l'oxygène ne soit fourni en continu. En revanche, au cours de la même période, la quantité d'autres nutriments utilisés est négligeable par rapport à la majeure partie des concentrations. Par conséquent, la plupart des processus microbiens aérobies sont limités en oxygène. C'est la raison pour laquelle le concept de transfert de masse gaz-liquide dans les bioprocédés est centré sur le transfert d'oxygène même si d'autres gaz tels que le dioxyde de carbone, l'hydrogène, le méthane et l'ammoniac peuvent également être impliqués.

En raison de l'influence des nutriments de la culture, la teneur maximale en oxygène est en fait inférieure à ce qu'elle serait dans l'eau pure.

La solubilité des gaz suit la loi d'Henry dans la plage de pression de gaz sur laquelle les fermenteurs sont exploités. Cela signifie que si la concentration d'oxygène dans la phase gazeuse augmente, le O2 proportion de la solution nutritive augmente. Par conséquent, le plus élevé O2 des pressions partielles sont atteintes lors de l'aération avec de l'oxygène pur. Par rapport à la valeur dans l'air (9 mg O2/l), 43 mg O2/l se dissout dans l'eau lorsque l'on considère l'oxygène pur.

Lorsque la température augmente, le O2 la solubilité diminue. Par exemple, la solubilité à 33 degrés Celsius est de 7,2 mg O2/l.

Pour que l'oxygène soit transféré d'une bulle de gaz à une cellule individuelle, plusieurs résistances partielles indépendantes doivent être surmontées (Fig.3).
* 1 résistance dans le film de gaz à la limite de phase
* 2 pénétration de la limite de phase entre la bulle de gaz et le liquide
* 3 transfert de la limite de phase au liquide
* 4 mouvements dans la solution nutritive
* 5 transfert à la surface de la cellule

Pour les fermentations réalisées avec des organismes unicellulaires tels que les bactéries et les levures, la résistance dans la limite de phase entre la bulle de gaz et le liquide est le facteur le plus important contrôlant la vitesse de transfert.

Les cellules microbiennes proches des bulles de gaz peuvent absorber l'oxygène directement à travers la limite de phase et le taux de transfert de gaz vers ces cellules est augmenté.

Dans les agglomérats cellulaires ou les pastilles, l'O2 le transfert au sein de l'agglomérat peut devenir le facteur limitant.

Le transfert de masse de l'oxygène dans le liquide peut être caractérisé par le taux de transfert d'oxygène (OTR) ou par le coefficient de transfert d'oxygène volumétrique (kLune). Ces valeurs ont été soigneusement examinées en tant que paramètre critique pour le fonctionnement du bioréacteur. Le taux de transfert d'oxygène et le coefficient de transfert d'oxygène volumétrique dépendent des paramètres suivants :
* la géométrie de la cuve : diamètre, capacité
* propriétés de mélange : puissance, configuration et taille de la turbine, chicanes
* système d'aération : taux de sparger, géométrie, emplacement
* la solution nutritive : composition, densité, viscosité
* le micro-organisme : morphologie, concentration
* l'agent antimousse utilisé
* la température

La source:


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Traitement PEG-silane : pourquoi incuber 18 heures à 60 degrés Celsius ? - La biologie

L'objectif principal du traitement des eaux usées est généralement de permettre l'évacuation des effluents humains et industriels sans danger pour la santé humaine ni dommage inacceptable pour l'environnement naturel. L'irrigation avec des eaux usées est à la fois l'élimination et l'utilisation et est en effet une forme efficace d'élimination des eaux usées (comme dans le traitement des terres à faible vitesse). Cependant, un certain degré de traitement doit normalement être fourni aux eaux usées municipales brutes avant qu'elles ne puissent être utilisées pour l'irrigation agricole ou paysagère ou pour l'aquaculture. La qualité des effluents traités utilisés en agriculture a une grande influence sur le fonctionnement et les performances du système eaux usées-sol-usine ou aquacole. Dans le cas de l'irrigation, la qualité requise des effluents dépendra de la ou des cultures à irriguer, des conditions du sol et du système de distribution des effluents adopté. Grâce à la restriction des cultures et à la sélection de systèmes d'irrigation qui minimisent les risques pour la santé, le degré de traitement des eaux usées avant l'application peut être réduit. Une approche similaire n'est pas réalisable dans les systèmes aquacoles et il faudra davantage se fier au contrôle par le traitement des eaux usées.

Le traitement des eaux usées le plus approprié à appliquer avant l'utilisation des effluents dans l'agriculture est celui qui produira un effluent répondant aux directives de qualité microbiologique et chimique recommandées à la fois à faible coût et avec des exigences opérationnelles et d'entretien minimales (Arar 1988). L'adoption d'un niveau de traitement aussi bas que possible est particulièrement souhaitable dans les pays en développement, non seulement du point de vue du coût mais aussi compte tenu de la difficulté d'exploiter des systèmes complexes de manière fiable. In many locations it will be better to design the reuse system to accept a low-grade of effluent rather than to rely on advanced treatment processes producing a reclaimed effluent which continuously meets a stringent quality standard.

Nevertheless, there are locations where a higher-grade effluent will be necessary and it is essential that information on the performance of a wide range of wastewater treatment technology should be available. The design of wastewater treatment plants is usually based on the need to reduce organic and suspended solids loads to limit pollution of the environment. Pathogen removal has very rarely been considered an objective but, for reuse of effluents in agriculture, this must now be of primary concern and processes should be selected and designed accordingly (Hillman 1988). Treatment to remove wastewater constituents that may be toxic or harmful to crops, aquatic plants (macrophytes) and fish is technically possible but is not normally economically feasible. Unfortunately, few performance data on wastewater treatment plants in developing countries are available and even then they do not normally include effluent quality parameters of importance in agricultural use.

The short-term variations in wastewater flows observed at municipal wastewater treatment plants follow a diurnal pattern. Flow is typically low during the early morning hours, when water consumption is lowest and when the base flow consists of infiltration-inflow and small quantities of sanitary wastewater. A first peak of flow generally occurs in the late morning, when wastewater from the peak morning water use reaches the treatment plant, and a second peak flow usually occurs in the evening. The relative magnitude of the peaks and the times at which they occur vary from country to country and with the size of the community and the length of the sewers. Small communities with small sewer systems have a much higher ratio of peak flow to average flow than do large communities. Although the magnitude of peaks is attenuated as wastewater passes through a treatment plant, the daily variations in flow from a municipal treatment plant make it impracticable, in most cases, to irrigate with effluent directly from the treatment plant. Some form of flow equalization or short-term storage of treated effluent is necessary to provide a relatively constant supply of reclaimed water for efficient irrigation, although additional benefits result from storage.

Conventional wastewater treatment consists of a combination of physical, chemical, and biological processes and operations to remove solids, organic matter and, sometimes, nutrients from wastewater. General terms used to describe different degrees of treatment, in order of increasing treatment level, are preliminary, primary, secondary, and tertiary and/or advanced wastewater treatment. In some countries, disinfection to remove pathogens sometimes follows the last treatment step. A generalized wastewater treatment diagram is shown in Figure 5.

The objective of preliminary treatment is the removal of coarse solids and other large materials often found in raw wastewater. Removal of these materials is necessary to enhance the operation and maintenance of subsequent treatment units. Preliminary treatment operations typically include coarse screening, grit removal and, in some cases, comminution of large objects. In grit chambers, the velocity of the water through the chamber is maintained sufficiently high, or air is used, so as to prevent the settling of most organic solids. Grit removal is not included as a preliminary treatment step in most small wastewater treatment plants. Comminutors are sometimes adopted to supplement coarse screening and serve to reduce the size of large particles so that they will be removed in the form of a sludge in subsequent treatment processes. Flow measurement devices, often standing-wave flumes, are always included at the preliminary treatment stage.

The objective of primary treatment is the removal of settleable organic and inorganic solids by sedimentation, and the removal of materials that will float (scum) by skimming. Approximately 25 to 50% of the incoming biochemical oxygen demand (BOD 5 ), 50 to 70% of the total suspended solids (SS), and 65% of the oil and grease are removed during primary treatment. Some organic nitrogen, organic phosphorus, and heavy metals associated with solids are also removed during primary sedimentation but colloidal and dissolved constituents are not affected. The effluent from primary sedimentation units is referred to as primary effluent. Table 12 provides information on primary effluent from three sewage treatment plants in California along with data on the raw wastewaters.

Table 12 : QUALITY OF RAW WASTEWATER AND PRIMARY EFFLUENT AT SELECTED TREATMENT PLANTS IN CALIFORNIA

Quality parameters (mg/l, except as otherwise indicated)

Los Angeles County Joint Plant

Biochemical oxygen demand,BOD5

Electrical conductivity, dS/m

Soluble sodium percentage, %

In many industrialized countries, primary treatment is the minimum level of preapplication treatment required for wastewater irrigation. It may be considered sufficient treatment if the wastewater is used to irrigate crops that are not consumed by humans or to irrigate orchards, vineyards, and some processed food crops. However, to prevent potential nuisance conditions in storage or flow-equalizing reservoirs, some form of secondary treatment is normally required in these countries, even in the case of non-food crop irrigation. It may be possible to use at least a portion of primary effluent for irrigation if off-line storage is provided.

Primary sedimentation tanks or clarifiers may be round or rectangular basins, typically 3 to 5 m deep, with hydraulic retention time between 2 and 3 hours. Settled solids (primary sludge) are normally removed from the bottom of tanks by sludge rakes that scrape the sludge to a central well from which it is pumped to sludge processing units. Scum is swept across the tank surface by water jets or mechanical means from which it is also pumped to sludge processing units.

In large sewage treatment plants (> 7600 m 3 /d in the US), primary sludge is most commonly processed biologically by anaerobic digestion. In the digestion process, anaerobic and facultative bacteria metabolize the organic material in sludge (see Example 3), thereby reducing the volume requiring ultimate disposal, making the sludge stable (nonputrescible) and improving its dewatering characteristics. Digestion is carried out in covered tanks (anaerobic digesters), typically 7 to 14 m deep. The residence time in a digester may vary from a minimum of about 10 days for high-rate digesters (well-mixed and heated) to 60 days or more in standard-rate digesters. Gas containing about 60 to 65% methane is produced during digestion and can be recovered as an energy source. In small sewage treatment plants, sludge is processed in a variety of ways including: aerobic digestion, storage in sludge lagoons, direct application to sludge drying beds, in-process storage (as in stabilization ponds), and land application.

The objective of secondary treatment is the further treatment of the effluent from primary treatment to remove the residual organics and suspended solids. In most cases, secondary treatment follows primary treatment and involves the removal of biodegradable dissolved and colloidal organic matter using aerobic biological treatment processes. Aerobic biological treatment (see Box) is performed in the presence of oxygen by aerobic microorganisms (principally bacteria) that metabolize the organic matter in the wastewater, thereby producing more microorganisms and inorganic end-products (principally CO 2 , NH 3 , and H 2 O). Several aerobic biological processes are used for secondary treatment differing primarily in the manner in which oxygen is supplied to the microorganisms and in the rate at which organisms metabolize the organic matter.

High-rate biological processes are characterized by relatively small reactor volumes and high concentrations of microorganisms compared with low rate processes. Consequently, the growth rate of new organisms is much greater in high-rate systems because of the well controlled environment. The microorganisms must be separated from the treated wastewater by sedimentation to produce clarified secondary effluent. The sedimentation tanks used in secondary treatment, often referred to as secondary clarifiers, operate in the same basic manner as the primary clarifiers described previously. The biological solids removed during secondary sedimentation, called secondary or biological sludge, are normally combined with primary sludge for sludge processing.

Common high-rate processes include the activated sludge processes, trickling filters or biofilters, oxidation ditches, and rotating biological contactors (RBC). A combination of two of these processes in series (e.g., biofilter followed by activated sludge) is sometimes used to treat municipal wastewater containing a high concentration of organic material from industrial sources.

iii. Rotating Biological Contactors

High-rate biological treatment processes, in combination with primary sedimentation, typically remove 85 % of the BOD 5 and SS originally present in the raw wastewater and some of the heavy metals. Activated sludge generally produces an effluent of slightly higher quality, in terms of these constituents, than biofilters or RBCs. When coupled with a disinfection step, these processes can provide substantial but not complete removal of bacteria and virus. However, they remove very little phosphorus, nitrogen, non-biodegradable organics, or dissolved minerals. Data on effluent quality from selected secondary treatment plants in California are presented in Table 13.

Table 13: QUALITY OF SECONDARY EFFLUENT AT SELECTED WASTEWATER TREATMENT PLANTS IN CALIFORNIA

Quality parameter (mg/I except as otherwise indicated)

Montecito Sanitary District

Biochemical oxygen demand, BOD 5

Electrical conductivity dS/m

Tertiary and/or advanced wastewater treatment is employed when specific wastewater constituents which cannot be removed by secondary treatment must be removed. As shown in Figure 3, individual treatment processes are necessary to remove nitrogen, phosphorus, additional suspended solids, refractory organics, heavy metals and dissolved solids. Because advanced treatment usually follows high-rate secondary treatment, it is sometimes referred to as tertiary treatment. However, advanced treatment processes are sometimes combined with primary or secondary treatment (e.g., chemical addition to primary clarifiers or aeration basins to remove phosphorus) or used in place of secondary treatment (e.g., overland flow treatment of primary effluent).

An adaptation of the activated sludge process is often used to remove nitrogen and phosphorus and an example of this approach is the 23 Ml/d treatment plant commissioned in 1982 in British Columbia, Canada (World Water 1987). The Bardenpho Process adopted is shown in simplified form in Figure 6. Effluent from primary clarifiers flows to the biological reactor, which is physically divided into five zones by baffles and weirs. In sequence these zones are: (i) anaerobic fermentation zone (characterized by very low dissolved oxygen levels and the absence of nitrates) (ii) anoxic zone (low dissolved oxygen levels but nitrates present) (iii) aerobic zone (aerated) (iv) secondary anoxic zone and (v) final aeration zone. The function of the first zone is to condition the group of bacteria responsible for phosphorus removal by stressing them under low oxidation-reduction conditions, which results in a release of phosphorus equilibrium in the cells of the bacteria. On subsequent exposure to an adequate supply of oxygen and phosphorus in the aerated zones, these cells rapidly accumulate phosphorus considerably in excess of their normal metabolic requirements. Phosphorus is removed from the system with the waste activated sludge.

Most of the nitrogen in the influent is in the ammonia form, and this passes through the first two zones virtually unaltered. In the third aerobic zone, the sludge age is such that almost complete nitrification takes place, and the ammonia nitrogen is converted to nitrites and then to nitrates. The nitrate-rich mixed liquor is then recycled from the aerobic zone back to the first anoxic zone. Here denitrification occurs, where the recycled nitrates, in the absence of dissolved oxygen, are reduced by facultative bacteria to nitrogen gas, using the influent organic carbon compounds as hydrogen donors. The nitrogen gas merely escapes to atmosphere. In the second anoxic zone, those nitrates which were not recycled are reduced by the endogenous respiration of bacteria. In the final re-aeration zone, dissolved oxygen levels are again raised to prevent further denitrification, which would impair settling in the secondary clarifiers to which the mixed liquor then flows.

An experimentation programme on this plant demonstrated the importance of the addition of volatile fatty acids to the anaerobic fermentation zone to achieve good phosphorus removal. These essential short-chain organics (mainly acetates) are produced by the controlled fermentation of primary sludge in a gravity thickener and are released into the thickener supernatent, which can be fed to the head of the biological reactor. Without this supernatent return flow, overall phosphorus removal quickly dropped to levels found in conventional activated sludge plants. Performance data over three years have proved that, with thickener supernatent recycle, effluent quality median values of 0.5-1.38 mg/l Ortho-P, 1.4-1.6 mg/l Total nitrogen and 1.4-2.0 mg/l nitrate-N are achievable. This advanced biological wastewater treatment plant cost only marginally more than a conventional activated sludge plant but nevertheless involved considerable investment. Furthermore, the complexity of the process and the skilled operation required to achieve consistent results make this approach unsuitable for developing countries.

In many situations, where the risk of public exposure to the reclaimed water or residual constituents is high, the intent of the treatment is to minimize the probability of human exposure to enteric viruses and other pathogens. Effective disinfection of viruses is believed to be inhibited by suspended and colloidal solids in the water, therefore these solids must be removed by advanced treatment before the disinfection step. The sequence of treatment often specified in the United States is: secondary treatment followed by chemical coagulation, sedimentation, filtration, and disinfection. This level of treatment is assumed to produce an effluent free from detectable viruses. Effluent quality data from selected advanced wastewater treatment plants in California are reported in Table 14. In Near East countries adopting tertiary treatment, the tendency has been to introduce pre-chlorination before rapid-gravity sand filtration and post-chlorination afterwards. A final ozonation treatment after this sequence has been considered in at least one country.

Disinfection normally involves the injection of a chlorine solution at the head end of a chlorine contact basin. The chlorine dosage depends upon the strength of the wastewater and other factors, but dosages of 5 to 15 mg/l are common. Ozone and ultra violet (uv) irradiation can also be used for disinfection but these methods of disinfection are not in common use. Chlorine contact basins are usually rectangular channels, with baffles to prevent short-circuiting, designed to provide a contact time of about 30 minutes. However, to meet advanced wastewater treatment requirements, a chlorine contact time of as long as 120 minutes is sometimes required for specific irrigation uses of reclaimed wastewater. The bactericidal effects of chlorine and other disinfectants are dependent upon pH, contact time, organic content, and effluent temperature.

Although not considered a step in the treatment process, a storage facility is, in most cases, a critical link between the wastewater treatment plant and the irrigation system. Storage is needed for the following reasons:

je. To equalize daily variations in flow from the treatment plant and to store excess when average wastwater flow exceeds irrigation demands includes winter storage.

ii. To meet peak irrigation demands in excess of the average wastewater flow.

iii. To minimize the effects of disruptions in the operations of the treatment plant and irrigation system. Storage is used to provide insurance against the possibility of unsuitable reclaimed wastewater entering the irrigation system and to provide additional time to resolve temporary water quality problems.

Table 14 : EFFLUENT QUALITY DATA FROM SELECTED ADVANCED WASTEWATER TREATMENT PLANTS IN CALIFORNIA 1


Indole test:

Indole tests looks for the presence or absence of tryptophanase enzyme production of the bacteria. If the enzyme is present, it will degrade the aminoacid tryptophan in the media and will produce Indole, ammonia and pyruvic acid. Indole will react with Kovac's reagent to produce a cherry red complex, which indicates a positive indole test. The absence of red color is indicative of tryptophan hydrolysis due to the lack of tryptophanse enzyme(Fig 3).


Analytical Methods for Monitoring Environmental Pollution

Iyyanki V. Muralikrishna , Valli Manickam , in Environmental Management , 2017

18.4.14.1 Oxygen Demand (Biochemical)

BOD in water is determined. Seeding with sewage organisms, and elimination of interferences from residual chlorine and other bactericidal substances should be carried out. The amount of pollution in the sample will govern the need for and the degree of dilution. Samples with low DO values can be aerated to increase the initial DO content above that required by the BOD. Air is bubbled through a diffusion tube into the sample for 5 min, or until the DO is at least 7 mg/L. On one portion of the aerated sample the DO is determined another portion is seeded and incubated for the BOD determination.


Packaging Selection for Solid Oral Dosage Forms

23.2.3.1 Desiccants and fillers

Desiccants are commonly used to keep products dry and stable. Dry desiccants can absorb moisture from air either by physical adsorption or by chemical reaction, and thus reduce the humidity in the headspace of sealed containers. Moisture sorption by silica gel is an example of physical adsorption, and sorption by calcium oxide is an example of a chemical reaction. Different types of desiccants and their moisture sorption capacities can be found in literature. 16 The most commonly used desiccants for solid pharmaceutical products are silica gel, clay, and molecular sieves.

Silica gel is an amorphous form of silica (SiO2 xH2O) and is highly porous. Silica gel particles are composed of an interconnecting network of microscopic pores (capillaries), and therefore have a very large surface area. The mechanisms of moisture adsorption by silica gel include surface adsorption and capillary condensation in the porous network. Silica gel works well at ambient temperature, but may have decreased adsorption rate and equilibrium moisture content at higher temperatures. The moisture in silica gel can be removed by drying at a temperature greater than 110°C. The current USP Chapter <671> recommends pre-drying silica gel desiccant at approximately 150°C to ensure the complete removal of adsorbed water.

Clay is a low cost and efficient desiccant at low temperature. The primary chemical composition of clay includes silica and aluminum oxide, magnesium oxide, calcium oxide, and ferric oxide. Moisture adsorption capacity may be different for different grades of clay desiccant. Therefore, their moisture adsorption isotherms must be verified during the desiccant selection process. Clay works well at ambient temperature, but at temperatures >50°C, it will likely lose moisture rather than absorb moisture. Similar to silica gel, clay can be dried at a temperature greater than 110°C.

A molecular sieve is a highly porous crystalline material with precise mono-dispersed pores into which certain sizes of molecules can fit, and thus, it can be used to separate one type of molecule from others. These pores are the channels in the crystalline structure of a material such as zeolite. The pore sizes of molecular sieves differ from silica gel, in that the pore size of a molecular sieve is small and precise, while that of silica gel is much larger with a broad distribution. Molecular sieves are available with different effective pore sizes, such as 3, 4, 5, and 10 Å. A molecular sieve with a 3 Å effective pore size can selectively adsorb water molecules, since the diameter of water molecule is approximately 3 Å, while a molecular sieve with 4 Å pore size can also adsorb nitrogen and oxygen, in addition to water. Molecular sieve desiccants have a very strong affinity and a high adsorptive capacity for water in an environment of low water concentration. At 25°C/10%RH, molecular sieves can adsorb water to approximately 14% of their own weight. This property makes it possible to create an extremely low humidity environment with a small amount of material. However, at any humidity greater than 50%RH at 25°C, the adsorption capacity of a molecular sieve is less than that of silica gel. For example, at 70%RH/25°C, a molecular sieve can absorb approximately 22% of moisture, while silica gel can absorb approximately 32% of moisture at the same condition. 16

Moisture sorption isotherms of different types of desiccants can be found in literature. 16 The equilibrium adsorptive capacities of silica gel and clay for moisture at different temperatures and humidities are shown in Fig. 23.3 . At humidities lower than 35%RH, moisture sorption capacities are similar for the two desiccants. At higher humidities, silica gel has a higher moisture capacity than clay. It is important to know that different grades of the same type of desiccant may have significantly different moisture sorption capacities. This holds true for clay and zeolite desiccants. Therefore, moisture sorption isotherms of desiccants must be verified for the selected desiccants. In addition, the moisture sorption capacity of desiccants is a function of temperature. This temperature dependency should be characterized during the selection process, particularly when the isotherm is intended for modeling packaging design for moisture protection at different temperatures.

Figure 23.3 . Moisture sorption isotherms of activated silica gel and bentonite clay.

The common process for using desiccants is to place a predetermined quantity of activated desiccant into containers with products and seal the containers. The quantity of desiccant to be used is important because an insufficient quantity will not provide the required protection, while excessive use of desiccant may lead to over-drying and an unnecessary increase in product cost. In many cases, overuse of desiccant is not a problem for product quality. However, over-drying of some hydrates may lead to the formation of unstable amorphous materials, and thus become detrimental to product quality. It is therefore important to understand the product characteristics, the degradation mechanism of the products, and the desired range of humidity for products before an appropriate quantity of desiccant can be determined. Once the desired range of humidity is determined, a suitable quantity of desiccant to use can be calculated based on the moisture sorption properties of both the desiccant and the drug product using a modeling method, as discussed later in this chapter.

The environmental conditions and packaging process for placing desiccants into product containers must be well-controlled in order to maintain the effectiveness of the desiccant because it may adsorb water vapor quickly when exposed to room air, thus reducing its protection capacity. For example, activated clay, silica gel, and molecular sieves can all absorb approximately 10% of water when exposed to 25°C/75%RH for 1 hour, 16 leading to a significant loss of protection effect for products. In fact, such an exposure can result in a complete loss of the protection effect of silica gel and clay if the desiccants are intended to maintain humidity lower than 20%RH. For container MVTR measurement, adsorption of water by exposure of desiccant to room air prior to filling into containers can lead to under-estimation of container MVTR because the internal humidity may exceed the requirement for a “sink” condition. Environmental humidity and exposure time for placing desiccant into containers must clearly be minimized, in order to prevent loss of desiccant effect. Similarly, when active packaging is used where desiccants or oxygen scavenger are pre-sealed in the containers, such as in the bottle caps, the manufacturing, shipping, and handling processes for the containers must also be well-controlled to prevent the loss of the effectiveness of the active packaging.

Care should also be taken when desiccants are used for gelatin capsules to prevent brittleness from loss of moisture. Gelatin capsule shells need approximately 12–16% water to maintain their physical strength, which corresponds with a relative humidity of approximately 40–65%RH at 25°C. Humidity lower than 30%RH will likely cause the capsules to become brittle. 17,18

Fillers such as cotton and rayon are also commonly copackaged with solid pharmaceutical dosage forms to restrain product movement during shipping. Cotton or rayon can sometimes cause instability problems for drug products. The reasons for this are that these fillers may contain residual oxidative agents that were used for their processing, and that fillers can unintentionally act as either a source of water or as a desiccant. The residual oxidative agents can cause degradation of some active pharmaceutical ingredients (APIs) or result in cross-linking of gelatin capsules or gelatin-coated tablets, if residual formaldehyde exists in the filler, leading to dissolution problems for the drug products. The moisture sorption capacity of cotton is another aspect to consider. The equilibrium moisture content of cotton is showed in Fig. 23.4 . It can absorb more than 6% of water at humidity higher than 60%RH at 25°C. If dry cotton is used, it can act as a type of desiccant, and absorb water from the copackaged products. If equilibrated at high humidity during storage prior to use, cotton can be a source of water for the copackaged dry products if the products are hygroscopic. Although the amount of cotton used for pharmaceutical products is small, the effects of cotton on moisture transfer may still be significant in some cases. Quantitative evaluation of the effect of cotton on product moisture content can be carried out using a modeling method, as discussed later in this chapter.


Méthodes

Reagents and cell lines

All chemical reagents were purchased from Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO.) unless otherwise specified. The experimental, small-molecule, Bcl-2 BH-3 domain inhibitor A-779024 was provided by Abbott Laboratories (Abbott Park, IL). The pan-Caspase inhibitor ZVAD-FMK was purchased from MBL International (Woburn, MA). Monoclonal antibodies to Akt, phospho-Akt, Beclin 1, Mcl-1, and LC-3 were purchased from Cell Signaling (Beverly, MA). Bax and Bcl-2 antibodies were purchased from BD Pharmingen (San Diego, CA). Caspase 3 antibody was purchased from Biosource (Camarillo, CA) polyclonal antibodies to Bcl-xL and actin was purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).The MiaPaca-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (Rockville, MD) and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum, sodium pyruvate, nonessential amino acids, L-glutamine, vitamins, penicillin, and streptomycin. Cells were maintained at 37ଌ in a humidified incubator containing 5% CO2.

Cell Cycle Analysis with Flow Cytometry

1 × 10 6 cells per treatment were plated in 100mm plates and allowed to recover overnight. Following treatments, cells were harvested with trypsin, washed in PBS, and resuspended in 150uL of FACSMAX solution (Genlantis, San Diego, CA) and incubated 10 minutes on ice to maximally disperse the cells. They were then fixed by adding ice cold 70% ethanol dropwise and kept at +4 degrees Celsius 1𠄷 days. Prior to analysis, cells were washed with PBS, then incubated with Ribonuclease A (200 mcg/ml) for 30 minutes at 37 degrees Celsius, and then stained with propridium iodide (10 mcg/ml). The cells were then analyzed using a Becton Dickenson FACscan (BD Biosciences, San Jose, CA) to determine the DNA fractions and the Sub-G0 (Apoptotic) cell population was quantified using Flowjo software (Treestar, inc., Ashland, OR).

Live Cell Fluorescence Microscopy for Autophagy

A MiaPaca-2 clonal population overexpressing eGFP-LC-3 was generated as previously described. These cells were seeded in Ibidi 8-chamber ultra-thin culture slides (Integrated BioDiagnostics Munich, Germany) and allowed to recover for 48 hours under standard culture conditions. Culture medium was then changed to include either A-779024 2 µM or Rapamycin 2µM and the cells were incubated for 1 or 6 hours before they were imaged using a IX-71 Delta Vision (Applied Precision Issaquah, Washington) inverted fluorescent microscope with a 60× 1.40 NA oil objective and FITC filter (excitation, 480 nm emission, 535 nm). During imaging the cells were kept at 37 degrees Celsius with an ASI 400 air stream incubator (Nevtek Williamsville, VA).

Immunocytochimie

MiaPaca-2 cells were cultured and treated with specified treatments in 4-well LAB-TEK ® chamber slides coated with poly-L lysine (Nalge Nunc International, Naperville, IL), then fixed first in 4% paraformaldehyde (1 min at room temperature) and then 100% ice-cold Methanol (10 minutes). Cells were washed in Phosphate buffered saline (PBS) and the cell membranes solubilized by incubation in PBS with 0.5% Triton X-100 for 20 min at room temperature. All incubations were done in a humidity chamber. Blocking of nonspecific binding was achieved by incubation in 0.1% Triton X-100 with 2% bovine serum albumin for 30 minutes at room temperature. Immunostaining consisted of incubation with monoclonal antibodies to BCL-2 (Pharmingen, 1:1000 dilution) and Beclin 1 (Cell Signaling, 1:500 dilution) overnight at 4 C. After 3 washes with 0.1% Triton X-100 in PBS slides were incubated with species-specific secondary antibodies (Alexa FluorR 488 anti-rabbit for Beclin 1, Alexa FluorR 647 anti-hamster for BCL-2 [Invitrogen, Carlsbad, CA]) for 1 hour at room temperature. The plastic chambers were then removed and coverslips mounted using Slowfade Gold ® mounting medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) containing 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) for nuclear staining. Slides were visualized with a IX-71 Delta Vision inverted fluorescent microscope equipped with a 60× 1.40 NA oil objective (Olympus, Melville, NY) using DAPI, FITC, and CY-5 filters. The signal intensities through each filter were matched at the time of imaging, and the images through each filter were individually optimized for brightness and background prior to generating the final composite images.

Western Blotting

Following treatments, cells were harvested with trypsin, pelleted by centrifugation, washed with PBS once, and then resuspended in lysis buffer (Cell Signaling #9803). Total lysate protein was quantified for equal gel loading using the BioRad protein assay (BioRad Labs, Hercules, CA) Lysates were mixed with a reducing loading buffer and heated to 100 degrees Celsius for 10 minutes, resolved by SDS-PAGE, and separated proteins were then electrophoretically transferred to 0.2-mm nitrocellulose membranes (Schleicher & Schuell Keene, NH). The blots were probed overnight with primary antibodies, and developed using species-specific secondary antibodies conjugated to horse-radish peroxidase. Immunoreactivity was detected by the enhanced chemiluminescence technique (Amersham Piscataway, NJ).

Immunoprecipitation

MiaPaca-2 cells were cultured under standard conditions to near-confluence, then harvested with Trypsin, pelleted by centrifugation, and washed with phosphate buffered saline. The cell pellet was lysed in an immunoprecipitation buffer (50 mM Tris [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% NP40) on ice for 5 min and clarified by centrifugation (10,000 g, 10 min). One mg of total protein used to immunoprecipitate Bcl-2, employing an immobilized monoclonal antibody to Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), which was incubated with the lysate for 45 min at 25ଌ and isolated using Protein A-agarose. Proteins were then immunoblotted as described above.


Guidance for School Administrators to Help Reduce the Spread of Seasonal Influenza in K-12 Schools

This document from the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), an agency of the U.S. Department of Health and Human Services, provides guidance to help reduce the spread of seasonal influenza (flu) among students and staff in K-12 schools. Recommendations are based on CDC&rsquos current knowledge of flu in the United States. CDC will continue to monitor flu activity and update this guidance as needed.

For the purpose of this guidance, &ldquoschools&rdquo will refer to both public and private institutions providing grades K-12 education to children and adolescents in group settings.

Fond

Flu seasons are unpredictable in a number of ways. Although widespread flu activity occurs every year, the timing, severity, and duration of it depend on many factors, including which flu viruses are spreading, the number of people who are susceptible to the circulating flu viruses, and how similar vaccine viruses are to the flu viruses that are causing illness. The timing of flu can vary from season to season. In the United States, seasonal flu activity most commonly peaks between December and March, but flu viruses can cause illness from early October to late May. Flu viruses are thought to spread mainly from person to person through coughs and sneezes of infected people. Less often, a person also might get the flu by touching a surface or object that has flu virus on it and then touching their own mouth, eyes, or nose.

Many respiratory infections spread from person to person and cause symptoms similar to those of flu. Therefore, the nonpharmaceutical recommendations in this document might help reduce the spread of not only flu, but also respiratory syncytial virus (RSV), rhinovirus, enterovirus D68 and other viruses and bacteria that can cause illness.

Each day, about 55 million students and 7 million staff attend the more than 130,000 public and private schools in the United States. By implementing the recommendations in this document, schools can help protect one-fifth of the country&rsquos population from flu. Collaboration is essential. CDC, the U.S. Department of Education, state/local public health and education agencies, schools, staff, students, families, businesses, and communities should work together to reduce the spread of flu and other respiratory infections.

School-aged children are at high risk of flu complications

People of all ages get sick with flu. School-aged children are a group with a high rate of flu illness.

Vaccination to prevent influenza is particularly important for people who are at high risk of serious complications from influenza. See People at High Risk of Developing Flu-Related Complications for a full list of age and health factors that confer increased risk.

Recommandations

Below are recommendations to help reduce the spread of flu in schools.

  • Encourage students, parents, and staff to get a yearly flu vaccine.
    • Teach students, parents, and staff that the single best way to protect against the flu is to get vaccinated each flu season. See Key Facts About Seasonal Flu Vaccine.
      • Seasonal flu vaccination is recommended for everyone 6 months of age and older unless they have a specific contraindication to flu vaccine. See Vaccination: Who Should Do It, Who Should Not, and Who Should Take Precautions. The seasonal flu vaccine protects against three or four influenza viruses that research indicates will be most common during the upcoming season. The vaccine viruses are reviewed each year and changed as needed based on international surveillance and scientists&rsquo estimations about which viruses will predominate during the upcoming season.
      • A number of different manufacturers produce trivalent (three component) influenza vaccines for the U.S. market. Some seasonal flu vaccines will be formulated to protect against four flu viruses (quadrivalent flu vaccines). See Key Facts About Seasonal Flu Vaccine and How Flu Vaccines Are Made for more information.
      • Flu vaccines have a very good safety record. Over the years, hundreds of millions of Americans have received seasonal flu vaccines. The most common side effects following flu vaccinations are mild, such as soreness, redness, tenderness, or swelling where the shot was given.
      • Flu vaccination efforts should begin by the end of October, if possible. However, as long as flu viruses are circulating, vaccination should continue to be offered throughout the flu season, even in January or later.
      • Encourage students, parents, and staff to take everyday preventive actions to stop the spread of germs.
        • Encourage students and staff to stay home when sick.
          • Teach students, parents, and staff the importance of staying home when sick until at least 24 hours after they no longer have a fever* or signs of a fever (chills, feeling very warm, flushed appearance, or sweating) without the use of fever-reducing medicine.
          • Review school policies, and consider revising those that make it difficult for students and staff to stay home when sick or when caring for others who are sick.
            • Implement flexible sick leave policies for students and staff.
            • Avoid the use of perfect attendance awards.
            • Cross-train staff so that others can cover for co-workers who need to stay home.
            • Teach students and staff to cover coughs and sneezes with a tissue or their bent arm. If they use a tissue, they should put the used tissue in a trash can and wash their hands.
            • Provide adequate supplies within easy reach, including tissues and no-touch trash cans.
            • Teach students and staff to wash hands often with soap and water for 20 seconds, dry hands with a paper towel, and use the paper towel to turn off the faucet. If soap and water are not available and hands are not visibly dirty, an alcohol-based hand sanitizer containing at least 60% alcohol may be used.
            • Include handwashing time in student schedules.
            • Provide adequate supplies, including clean and functional handwashing stations, soap, paper towels, and alcohol-based hand sanitizer.
            • Routinely clean surfaces and objects that are touched often, such as desks, countertops, doorknobs, computer keyboards, hands-on learning items, faucet handles, and phones. Empty trash cans as needed.
            • Use general cleaning products that you normally use. Always follow product label directions. Additional disinfection beyond routine cleaning is not recommended.
            • Provide adequate supplies, such as general EPA-registered cleaning products, gloves, disinfecting wipes, and no-touch trash cans.
            • Match your cleaning activities to the types of germs you want to remove or kill.
              • Flu viruses are relatively fragile, so standard practices, such as cleaning with soap and water, can help remove and kill them.
              • Studies have shown that the flu virus can live and potentially infect a person for only 2 to 8 hours after being deposited on a surface. Therefore, special sanitizing processes beyond routine cleaning, including closing schools to clean every surface in the building, are not necessary or recommended to slow the spread of flu, even during a flu outbreak.
              • Some schools may include other cleaning and disinfecting practices in their standard procedures to address germs that are not removed or killed by soap and water alone.
              • Teach students, parents, and staff the signs and symptoms of flu, emergency warning signs, and high risk groups. See lists at the beginning of this document.
                • Those who get flu-like symptoms at school should go home and stay home until at least 24 hours after they no longer have a fever or signs of a fever without the use of fever-reducing medicine. Those who have emergency warning signs should get immediate medical care. See The Flu: What To Do If You Get Sick.
                • Those who get flu-like symptoms and are at high risk of severe flu illness should ask a health care professional if they should be examined. See People at High Risk of Developing Flu&ndashRelated Complications.
                • Antiviral drugs are prescription drugs that can treat the flu. These drugs can reduce the number of days that a person is sick and also may prevent serious flu complications, but not everyone needs to be treated.
                • Antiviral drugs work best when started within the first 2 days of illness, but they also may help reduce the risk of severe illness even if started 2 or more days after onset of illness for persons who are very sick.
                • Although most people will recover from flu without treatment, antiviral drugs are recommended for people with flu who require treatment in the hospital have a progressive, severe, or complicated illness or are at high risk of severe flu because of an underlying medical condition or their age.
                • Follow your local flu situation through close communication with state and local health officials.
                • Update emergency plans so that they are in place before an outbreak occurs.

                Note de bas de page

                *Many authorities use either 100 (37.8 degrees Celcius) or 100.4 F (38.0 degrees Celsius) as a cut-off for fever, but this number actually can range depending on factors such as the method of measurement and the age of the person, so other values for fever could be appropriate. CDC has public health recommendations that are based on the presence (or absence) of fever. What is meant by this is that the person&rsquos temperature is not elevated beyond their norm.


                Voir la vidéo: Silane-Modified Polymers (Mai 2022).