Informations

22.4 : Plaques de gélose au sang (BAP) - Biologie

22.4 : Plaques de gélose au sang (BAP) - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Introduction

La Blood Agar est un milieu clinique important. (1)

Il existe deux types d'hémolyse. L'alpha-hémolyse (α) est causée par des dommages (mais pas par la lyse) des globules rouges dans le sang ; le milieu est translucide avec une teinte verdâtre autour des colonies (1). La bêta-hémolyse (β) est la lyse des globules rouges et le milieu semble complètement transparent autour des colonies.

Les bactéries non hémolytiques (souvent appelées gamma-hémolyse, ) ne présentent ni lyse ni élimination d'aucune sorte.

(Non disponible pendant les inconnues)

Matériaux

  • Des gants
  • 1 plaque de gélose au sang (BAP)/groupe
  • Lactococcus lactis
  • Staphylococcus aureus (Une inclinaison par table est fournie à la table avant)
  • Staphylococcus epidermidis

Procédures

  1. Étiquetez les plaques et "divisez" en 3 quadrants, en étiquetant chaque quadrant avec le nom de l'un des 3 organismes.
  2. Inoculer les 3 organismes sur un BAP et poignarder l'inoculation avec la boucle le long de la ligne de strie.

Alpha (α) Hémolyse (Lactococcus lactis)

Bêta (β) Hémolyse (Staphylococcus aureus)

Gamma (γ) Hémolyse (Staphylococcus epidermidis)

Sécurité

Staphylococcus aureus est un organisme BSL2. Porter des gants lors de la manipulation.

Résultats

Enregistrez vos observations.

Bactérie

Modèle d'hémolyse

La description

Conclusion

  • Dans vos propres mots, expliquez le mécanisme derrière la Blood Agar (comment cela fonctionne) et pourquoi vous pensez que c'est un bon milieu de croissance pour les bactéries exigeantes.

Plaques de gélose au sang

Les géloses au sang améliorent la croissance des microbes exigeants (difficiles) et déterminent les réactions hémolytiques. Ces géloses ne doivent être utilisées qu'au niveau collégial et universitaire.

Si votre expérience nécessite une gélose au sang, remplacez-la par le même type de gélose sans sang. Cette substitution contribue à assurer la sécurité dans votre laboratoire et réduit le risque de croissance fastidieuse d'agents pathogènes.


Qu'est-ce qui peut pousser sur une plaque de gélose nutritive ?

Bactéries

Chaque colonie circulaire distincte doit représenter une cellule ou un groupe bactérien individuel qui s'est divisé à plusieurs reprises. Étant conservées au même endroit, les cellules résultantes se sont accumulées pour former une tache visible. La plupart des colonies bactériennes apparaissent de couleur blanche, crème ou jaune et de forme assez circulaire.

Bacillus subtilis(3)
Proteus vulgaris(4)
Staphylococcus aures(5)
Streptococcus pyogenes(6)

Levures

La levure, un type de champignon (pluriel pour champignon), se trouve dans de nombreux endroits de la nature, aux laboratoires de recherche et même dans les cuisines de tous les jours pour la cuisson. Les colonies de levures ressemblent généralement aux colonies bactériennes. Certaines espèces, telles que Candidose, peut se développer sous forme de taches blanches avec une surface brillante.

Candida albicans) est un type de levure qui peut se développer à la surface de la peau(7)
Colonies de levures rondes(8)
Colonies de levures roses(9)

Moules

Les moisissures sont en fait des champignons, et elles apparaissent souvent gris blanchâtre, avec des bords flous. Ils se transforment généralement en une couleur différente, du centre vers l'extérieur. Deux exemples de moules sont présentés ci-dessous :

Moisissure verte (Trichoderma harzianum)(10)
Moisissure noire (Aspergillus nidulaus)(11)

Autres champignons

Des colonies vert mousse, un nuage blanc ou un anneau de spores peuvent être attribués à la croissance de Aspergillus, ce qui est courant dans des infections fongiques telles que le pied d'athlète. Voici un exemple de ce que Aspergillus ressemble à:


Microbiologie - 010 - Hémolyse

Certaines bactéries sont capables de décomposer les cellules sanguines par un processus appelé hémolyse. Pour tester l'activité hémolytique dans une souche de bactéries, inoculer simplement une plaque de gélose au sang avec une culture pure de la souche d'intérêt. Les plaques de gélose au sang contiennent du sang de mammifère comme source de nutriments, mais cela nous permet également d'observer comment une bactérie interagit avec le sang. Remarquez comment une plaque de gélose au sang non ensemencée est rouge et opaque. Après avoir incubé une plaque de gélose au sang inoculée, observez le milieu autour des bactéries qui s'y développent. Recherchez les changements dans la couleur rouge opaque. Si la zone autour de la bactérie devient transparente, cette souche présente une hémolyse complète, également connue sous le nom de bêta-hémolyse. Une telle souche serait appelée bêta-hémolytique. Remarquez comment la gélose est complètement transparente, montrant des objets derrière la plaque. Si le milieu autour des bactéries prend une couleur vert foncé mais ne devient pas transparent, les bactéries présentent une hémolyse incomplète ou alpha-hémolyse. Ces bactéries sont alpha-hémolytiques. Remarquez comment le milieu est décoloré, mais les objets derrière la plaque de gélose au sang ne peuvent pas être vus. On dit que les bactéries qui se développent sur la gélose au sang mais ne modifient pas du tout l'apparence du milieu présentent une hémolyse gamma et sont appelées bactéries gamma hémolytiques. Savoir de quel type d'hémolyse une souche bactérienne est capable peut être utile pour identifier plusieurs types de bactéries, en particulier les organismes isolés à partir de tissus humains tels que les espèces Streptococcus et Staphylococcus.

Certaines bactéries sont capables de décomposer les cellules sanguines par un processus appelé hémolyse. Savoir de quel type d'hémolyse une souche bactérienne est capable peut être utile pour identifier plusieurs types de bactéries, en particulier les organismes isolés de tissus humains tels que Streptocoque et Staphylocoque espèce.


8 conseils pour verser des plaques de gélose parfaites à chaque fois

1. Utilisez une recette

Complétez le milieu selon la recette, puis ajoutez la quantité désirée d'agar (normalement environ 1% w/v) et remuez. Si vous autoclavez sans remuer, avec l'agarose flottant encore au-dessus du liquide, vous obtenez un gâteau d'agarose dans le milieu. Intéressant, mais inutile.

Lors de la préparation de la gélose, n'utiliser que les 3/4 du volume du flacon. Cela permet aux bulles de monter pendant que la gélose fond au micro-ondes (et vous évite de nettoyer la gélose débordante du micro-ondes !).

2. Autoclaver

Autoclavez votre milieu pendant 25 minutes. Après l'autoclavage, vous pouvez bien sûr stocker le mélange médium-agar dans une bouteille en verre trempé puis le faire fondre au micro-ondes ou au bain-marie si nécessaire. Assurez-vous d'utiliser des bouteilles en verre trempé, sinon un désastre (voir #2) peut frapper.

3. Refroidissez-le !

Refroidir le mélange milieu-agar à 55°C. Pour des résultats systématiquement cohérents, faites le refroidissement pendant quelques heures dans un bain-marie à 55°C. La gélose commence à se solidifier à environ 50°C. L'utilisation du bain-marie signifie que vous pouvez constamment refroidir le mélange juste au-dessus de la température de solidification.

Avant d'utiliser un bain-marie, je le refroidissais simplement à l'air, mais je l'oubliais inévitablement et je revenais pour constater que la solidification avait déjà commencé - les plaques grumeleuses ne sont pas bonnes pour l'étalement !

4. Complétez-le

Vous pouvez maintenant ajouter des antibiotiques ou des suppléments et être sûr que la gélose est à une température appropriée car vous l'avez refroidie dans le bain-marie.

5. Versez les assiettes

Utilisez environ 30 ml du mélange gélose-milieu pour chaque plaque lors de l'utilisation d'une plaque de 100 mm de diamètre. Moins il y a de mélange gélose-milieu dans chaque assiette, plus ils se dessèchent facilement. 30 ml sont une bonne quantité pour un stockage à long terme, 10 à 20 ml suffisent si vous comptez utiliser les plaques assez rapidement.

Pour plus de cohérence, je recommande d'utiliser une pipette sérologique. Aspirez 2 à 3 ml de plus que nécessaire pour minimiser les bulles d'air dans l'assiette.

6. Laissez reposer

S'il y a des bulles dans les assiettes, passez brièvement la flamme dessus pour les faire éclater. Erreur classique : essayer de déplacer les assiettes avant qu'elles ne se mettent en place ne fait que demander des ennuis. Laissez-les tranquilles (et admirez peut-être vos plaques de gélose parfaites pendant que vous attendez) !

7. Se sécher

Sécher les plaques dans la hotte à flux laminaire avec le couvercle légèrement ouvert pendant 30 minutes (ou dans un incubateur à 37 °C pendant 2 à 3 heures, ou à température ambiante pendant 2 à 3 jours). Le séchage de la plaque est très important pour le stockage des plaques et la croissance des colonies sur celles-ci.

Si vous ne séchez pas les plaques, l'humidité s'évaporera et se condensera sur le couvercle pendant le stockage ou l'incubation et vous donnera d'horribles plaques humides. Au pire, l'humidité peut affecter le placage de vos cellules. Utilisez une minuterie pour vous rappeler quand les 30 minutes sont écoulées car - d'après mon expérience - il est très facile d'oublier vos assiettes et de revenir pour constater que vos assiettes se sont transformées en chips / chips d'agar. Délicieux.

8. Utilisez-le ou stockez-le

Une fois que vous avez versé vos plaques de gélose parfaites, vous pouvez les utiliser immédiatement ou les sceller pour une utilisation ultérieure. Vous pouvez utiliser du Parafilm ou les mettre dans le sac dans lequel les plaques sont fournies pour un rangement facile. Conserver les plaques à 4°C. Les directives suggèrent d'utiliser des plaques de gélose dans un délai d'environ 2 à 4 semaines.

Selon les additifs que vous avez inclus, la durée de conservation des assiettes préparées peut être plus courte - assurez-vous de vérifier cela avant de commencer afin de ne pas perdre votre temps (et vos ressources) à fabriquer trop d'assiettes.

Un moyen rapide d'étiqueter vos plaques est d'avoir un code couleur pour chaque type d'antibiotique et de milieu que vous avez tendance à utiliser (par exemple, rouge pour l'ampicilline, noir pour la kanamycine, vert pour LB, bleu pour M9). Empilez les assiettes et utilisez le marqueur de laboratoire de couleur appropriée pour tracer une ligne sur toute la pile. Assurez-vous cependant de garder le code couleur à portée de main.

Maintenant, vous devriez avoir des plaques de gélose parfaites à chaque fois. Si vous avez d'autres idées ou ajouts à ce protocole, veuillez laisser un commentaire.

Publié à l'origine le 5 juillet 2011. Révisé et mis à jour en février 2021.


Le nombre de milieux disponibles pour cultiver des bactéries est considérable. Certains milieux sont considérés comme des milieux à usage général et favorisent la croissance d'une grande variété d'organismes. Un excellent exemple de support tout usage est bouillon de soja tryptique (TSB). Des milieux spécialisés sont utilisés dans l'identification des bactéries et sont complétés par des colorants, des indicateurs de pH ou des antibiotiques. Un type, médias enrichis, contient des facteurs de croissance, des vitamines et d'autres nutriments essentiels pour favoriser la croissance de organismes exigeants, organismes incapables de fabriquer certains nutriments et nécessitant leur ajout au milieu. Lorsque la composition chimique complète d'un milieu est connue, on parle de milieu chimiquement défini. Par exemple, dans EZ moyen, tous les composants chimiques individuels sont identifiés et les quantités exactes de chacun sont connues. Dans médias complexes, qui contiennent des extraits et des digestats de levures, de viande ou de plantes, la composition chimique précise du milieu n'est pas connue. Les quantités de composants individuels sont indéterminées et variables. Bouillon nutritif, bouillon tryptique de soja et infusion cerveau-cœur, sont tous des exemples de médias complexes.

Figure 1. Sur cette plaque de gélose MacConkey, les colonies d'E. coli fermentant le lactose sont rose vif. Serratia marcescens, qui ne fermente pas le lactose, forme une traînée de couleur crème sur le milieu bronzé. (crédit : Société américaine de microbiologie)

Les milieux qui inhibent la croissance de micro-organismes indésirables et soutiennent la croissance de l'organisme d'intérêt en fournissant des nutriments et en réduisant la compétition sont appelés médias sélectifs. Un exemple de milieu sélectif est Gélose MacConkey. Il contient des sels biliaires et du cristal violet, qui interfèrent avec la croissance de nombreux bactéries gram-positives et favoriser la croissance de bactéries gram-négatives, en particulier le Entérobactéries. Ces espèces sont communément appelées entériques, résident dans l'intestin et sont adaptées à la présence de sels biliaires. Les cultures d'enrichissement favoriser la croissance préférentielle d'un micro-organisme souhaité qui représente une fraction des organismes présents dans un inoculum. Par exemple, si nous voulons isoler les bactéries qui décomposent le pétrole brut, bactéries hydrocarbonoclastes, des repiquages ​​séquentiels dans un milieu qui ne fournit du carbone que sous forme de pétrole brut enrichiront les cultures en bactéries oléagineuses. Les médias différentiels permettent de distinguer facilement les colonies de différentes bactéries par une modification de la couleur des colonies ou de la couleur du milieu. Les changements de couleur sont le résultat de produits finaux créés par l'interaction d'enzymes bactériennes avec des substrats différentiels dans le milieu ou, dans le cas de réactions hémolytiques, de la lyse des globules rouges dans le milieu. Sur la figure 1, la fermentation différentielle du lactose peut être observée sur gélose MacConkey. Les fermenteurs lactose produisent de l'acide, qui fait virer au rose vif le milieu et les colonies des fermenteurs forts. Le milieu est complété par l'indicateur de pH rouge neutre, qui vire au rose vif à pH bas. Les milieux sélectifs et différentiels peuvent être combinés et jouer un rôle important dans l'identification des bactéries par des méthodes biochimiques.

Pensez-y

  • Distinguer les milieux complexes et chimiquement définis.
  • Distinguer les milieux sélectifs et d'enrichissement.

Le pique-nique de fin d'année

Le service de microbiologie fête la fin de l'année scolaire en mai en organisant son traditionnel pique-nique sur le green. Les discours s'éternisent pendant quelques heures, mais finalement tous les professeurs et étudiants peuvent se plonger dans la nourriture : salade de poulet, tomates, oignons, salade et tarte à la crème. Le soir, tout le département, à l'exception de deux étudiants végétariens qui n'ont pas mangé de salade de poulet, est pris de nausées, de vomissements, de haut-le-cœur et de crampes abdominales. Plusieurs personnes se plaignent de diarrhée. Un patient présente des signes de choc (pression artérielle basse). Des échantillons de sang et de selles sont prélevés sur les patients et une analyse de tous les aliments servis au repas est effectuée.

Les bactéries peuvent causer gastro-entérite (inflammation de l'estomac et du tractus intestinal) soit en colonisant et en se reproduisant chez l'hôte, ce qui est considéré comme une infection, soit en sécrétant des toxines, ce qui est considéré comme une intoxication. Les signes et symptômes d'infections sont généralement retardés, tandis que l'intoxication se manifeste en quelques heures, comme cela s'est produit après le pique-nique.

Les échantillons de sang des patients n'ont montré aucun signe d'infection bactérienne, ce qui suggère en outre qu'il s'agissait d'un cas d'intoxication. Étant donné que l'intoxication est due à des toxines sécrétées, les bactéries ne sont généralement pas détectées dans les échantillons de sang ou de selles. gélose MacConkey et gélose sorbitol-MacConkey plaques et xylose-lysine-désoxycholate (XLD) les plaques ont été inoculées avec des échantillons de selles et n'ont révélé aucune colonie de couleur inhabituelle, et aucune colonie noire ou blanche n'a été observée sur XLD. Tous les fermenteurs de lactose sur gélose MacConkey fermentent également le sorbitol. Ces résultats ont exclu les agents courants des maladies d'origine alimentaire : E. coli, Salmonelle spp., et Shigella spp.

Figure 2. Cocci à Gram positif en grappes. (crédit: Centers for Disease Control and Prevention)

L'analyse de la salade de poulet a révélé un nombre anormal de cocci à Gram positif disposés en grappes (figure 2). Une culture de cocci à Gram positif libère des bulles lorsqu'elle est mélangée avec du peroxyde d'hydrogène. La culture a tourné gélose au sel de mannitol jaune après une incubation de 24 heures.

Tous les tests indiquent Staphylococcus aureus comme l'organisme qui sécrète la toxine. Des échantillons de la salade ont montré la présence de bactéries cocci à Gram positif en grappes. Les colonies étaient positives pour la catalase. Les bactéries se sont développées sur gélose au sel de mannitol fermentant le mannitol, comme le montre le passage au jaune du milieu. L'indicateur de pH dans la gélose au sel de mannitol est le rouge de phénol, qui vire au jaune lorsque le milieu est acidifié par les produits de fermentation.

La toxine sécrétée par S. aureus est connu pour provoquer une gastro-entérite sévère. L'organisme a probablement été introduit dans la salade pendant la préparation par le manipulateur d'aliments et s'est multiplié pendant que la salade était maintenue à la température ambiante chaude pendant les discours.

  • Quels sont les autres facteurs qui ont pu contribuer à la croissance rapide de S. aureus dans la salade de poulet?
  • Pourquoi serait S. aureus ne pas être inhibé par la présence de sel dans la salade de poulet ?

Concepts clés et résumé

  • Milieu chimiquement défini ne contiennent que des composants chimiquement connus.
  • Médias sélectifs favoriser la croissance de certains micro-organismes tout en inhibant d'autres.
  • Médias enrichis contiennent des nutriments essentiels ajoutés dont un organisme spécifique a besoin pour se développer
  • Média différentiel aider à distinguer les bactéries par la couleur des colonies ou le changement de milieu.

Choix multiple

La gélose EMB est un milieu utilisé pour l'identification et l'isolement de bactéries pathogènes. Il contient des protéines de viande digérées comme source de nutriments organiques. Deux colorants indicateurs, l'éosine et le bleu de méthylène, inhibent la croissance des bactéries à Gram positif et font la distinction entre les organismes fermentant le lactose et les organismes non fermentant le lactose. Les fermenteurs de lactose forment des colonies vert métallique ou violet foncé, tandis que les fermenteurs sans lactose forment des colonies complètement incolores. La gélose EMB en est un exemple ?

  1. un support sélectif uniquement
  2. un support différentiel uniquement
  3. un milieu sélectif et un milieu chimiquement défini
  4. un milieu sélectif, un milieu différentiel et un milieu complexe

Haemophilus influenzae doit être cultivée sur de la gélose au chocolat, qui est une gélose au sang traitée à la chaleur pour libérer les facteurs de croissance dans le milieu. H. influenzae est décrit comme ________.

Remplir les trous

La gélose au sang contient de nombreux nutriments non précisés, favorise la croissance d'un grand nombre de bactéries, et permet la différenciation des bactéries selon l'hémolyse (dégradation du sang). Le médium est ________ et ________.

La gélose Rogosa contient de l'extrait de levure. Le pH est ajusté à 5,2 et décourage la croissance de nombreux micro-organismes cependant, toutes les colonies se ressemblent. Le médium est ________ et ________.

Pensez-y

Quelle est la différence majeure entre une culture d'enrichissement et une culture sélective ?

Esprit critique

Haemophilus influenzae pousse mieux à 35–37 °C avec

5% de CO2 (ou dans un pot à bougie) et nécessite de l'hémine (facteur X) et du nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD, également connu sous le nom de facteur V) pour sa croissance. [1] À l'aide du vocabulaire appris dans ce chapitre, décrivez H. influenzae.


Pour savoir si une hémolyse s'est produite, vous devez effectuer une séquence d'isolement sur la plaque de gélose au sang. Le milieu est incubé pendant la nuit et sera inspecté pour tout signe d'hémolyse.

Si la couleur du milieu est altérée comme caractérisée par un milieu sombre ou décoloré, cela signifie que l'organisme a subi une alpha-hémolyse. En revanche, l'hémolyse est bêta-hémolytique si le milieu est clarifié sous croissance. Si la couleur du milieu n'a pas changé, cela signifie que le milieu constitue une gamma-hémolyse. (8, 9 et 10)


Identification d'un staphylocoque, d'un streptocoque ou d'un entérique inconnu

Ce laboratoire devrait vous fournir les informations de base et les techniques dont vous aurez besoin pour effectuer avec succès des tests biochimiques afin d'identifier des échantillons bactériens inconnus. Le site Web du micro-laboratoire, votre manuel, le Web et les livres assortis disponibles dans le laboratoire seront les documents de référence nécessaires pour que vous puissiez terminer avec succès les prochaines semaines de travail en laboratoire.

  • Chaque paire recevra un organisme inconnu à identifier. Vous effectuerez des tests appropriés pour votre organisme afin de déterminer l'identification du genre et de l'espèce.
  • Chaque paire peut avoir à présenter des informations sur l'organisme spécifique qu'ils ont identifié, y compris : les résultats des tests, où cet organisme fait partie de la flore normale, quand et où cet organisme devient un agent pathogène, les maladies possibles que l'organisme provoque.
  • Pour chaque test biochimique que vous effectuez, assurez-vous d'enregistrer les éléments suivants dans votre livre de laboratoire :
    • A quoi ressemble un résultat de test positif ?
    • Quelle est la base biochimique du test ?

    Flux de travail

    Staphylocoques

    Les espèces de Staphylococcus sont une flore normale répandue à la surface du corps. Ce sont également des agents pathogènes importants. Certaines des maladies les plus courantes causées par les espèces de Staphylococcus comprennent : l'impétigo, le syndrome de choc toxique, la bactériémie, l'endocardite, la folliculite furoncle (furoncles) et l'ostéomyélite (abcès osseux). De nombreuses espèces de Staphylococcus ont la capacité de former des biofilms qui peuvent ensuite coloniser des structures telles que des cathéters médicaux, des stents, des valves cardiaques, des prothèses, des shunts et des valves.

    Les espèces cliniquement significatives sont généralement séparées en staphylocoques à coagulase positive (S. aureus) et à coagulase négative (CoNS) (S. epidermidis, S. haemolyticus et S. saprophyticus).

    Streptocoques

    De nombreux membres du genre Streptococcus sont une flore normale de la bouche, du nez et de la gorge. Le genre Streptococcus est un groupe complexe causant un large éventail de maladies telles que : le rhumatisme articulaire aigu, l'impétigo, la pharyngite, la laryngite, le syndrome de choc toxique, la scarlatine et l'endocardite.
    Les streptocoques sont souvent classés en fonction de l'hémolyse qui peut être vue par leur réaction sur la gélose au sang. Les espèces alpha-hémolytiques produisent de l'alpha-hémolysine qui réduit l'hémoglobine (rouge) en méthémoglobine (vert) provoquant une zone brunâtre ou verdâtre autour de la colonie. Les espèces bêta-hémolytiques produisent une hémolysine qui forme une zone claire autour de la colonie, indiquant une lyse complète des globules rouges. Les espèces hémolytiques gamma sont non hémolytiques et n'ont aucun effet apparent sur les globules rouges.

    Entériques

    Les entériques à Gram négatif sont importants à la fois en tant que flore naturelle dans le tractus intestinal et en tant que pathogènes de maladies dans le tractus gastro-intestinal et d'autres sites. Quatre familles principales avec de nombreux genres et espèces comprennent les entérobactéries à Gram négatif : Enterobacteriacea, Pseuodmonadaceae, Vibrionaceae et Camplyobacteraceae. Vous ne travaillerez qu'avec des organismes des deux premières familles.

    Procédure de laboratoire

    Nous avons inclus ci-dessous la procédure de base pour effectuer de nombreux tests biochimiques courants. Vous trouverez des procédures plus spécifiques pour un test biochimique spécifique dans les pages suivantes. Des informations plus complètes sur les médias différentiels sélectifs et ampères peuvent être obtenues en consultant les manuels Difco en laboratoire. Vous devrez rechercher le test individuel pour une description plus détaillée, y compris la base biochimique de chaque test.

    Tests biochimiques pour les staphylocoques

    Tableau 1 : Brève description des tests biochimiques pour les organismes Staphylococcus.

    Test Brèves instructions Résultats probables
    TSA Supports de maintenance générale pour Staphs Déterminer la macromorphologie
    Coloration de Gram Pour confirmer la pureté de la culture Les staphylocoques et les streptocoques sont à Gram positif Les entériques sont à Gram négatif
    McFarland
    Standard
    Diluer votre organisme dans un tube d'eau stérile pour obtenir une turbidité équivalente à un test standard de 0,5 McFarland. Tenez votre tube dilué et l'étalon de test McFarland 0,5 contre la carte de référence McFarland à lignes noires pour évaluer avec précision la turbidité.
    Coagulase Ajouter une boucle pleine ou 0,5 ml d'une culture pure à 0,5 ml de plasma de lapin. Tourner doucement le tube pour mélanger, ne pas secouer. Incuber 24 heures à 37°C. La présence de caillot indique S. aureus
    Sensibilité du disque antibiotique à la novobiocine Diluer les colonies d'une culture pure dans une solution saline stérile à une norme de 0,5 McFarland. Tamponnez la moitié de la surface d'une plaque de gélose au sang. Placez un disque de novobiocine légèrement sur la surface. Incuber 24h à 37°C. Une zone d'inhibition de la croissance ≤16 mm de diamètre dans un staphylocoque à coagulase(-) indique une S. saprophyticus. Voir résultats probables tableau 2 ci-dessous.
    Hémolyse Strie l'autre moitié de la plaque de gélose au sang pour vérifier l'hémolyse. Poignarder dans la surface de la gélose à la dernière partie de votre strie. Incuber 24h à O2. La bêta-hémolyse est révélatrice de S. aureus. Voir résultats probables tableau 2 ci-dessous.

    Tableau 2 : Résultats probables pour les organismes Staphylococcus

    Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylocoque xylosus
    Macromorphologie Crémeux/Bronze Moyen Crémeux/bronzage Pinpoint Blanc Petit Marge ondulée crémeuse/bronzée Jaune/Orange Moyen
    FTM Anaérobie facultative Anaérobie facultative Anaérobie facultative Anaérobie facultative Anaérobie facultative
    Motilité Immobile Immobile Immobile Immobile Immobile
    catalase Positif Positif Positif Positif Positif
    Oxydase Négatif Négatif Négatif Négatif Négatif
    Coagulase Positif Négatif Négatif Négatif Négatif
    Novobiocine Sensible Sensible Sensible Résistant Résistant
    Hémolyse Alpha Prime ou Beta Hémolyse Hémolyse Alpha ou Alpha Prime Alpha Prime ou Beta Hémolyse Alpha Hémolyse Alpha Hémolyse

    Hémolyse - Gélose au sang

    Utilisation prévue

    La gélose au sang est utilisée pour favoriser la croissance d'organismes exigeants et pour déterminer le type d'hémolyse (destruction des parois des globules rouges) qu'un organisme produit.

    Principe

    La gélose au sang est un milieu riche qui a été complété avec du sang frais à 5-10 %. La réponse hémolytique peut dépendre du type de sang. Le sang de mouton est couramment utilisé, mais certains organismes nécessitent du sang de lapin ou de bovin.

    Procédure de test

    1. Strier une plaque de gélose au sang pour l'isolement.
      • Facultatif : faites votre dernière série avec une aiguille et piquez dans la gélose. Cela donne généralement des zones d'hémolyse bêta claires et fiables et est particulièrement important pour voir les effets de la streptolysine O qui est labile à l'oxygène. Voir page 84 du manuel Difco/BBL.
    2. Incuber les plaques à 37°C pendant 24 à 48 heures. Les organismes streptococciques doivent être incubés dans le CO2 incubateur.
      • La plaque aura une couleur rouge brunâtre après 48 heures.

    Résultats

    Vous pouvez différencier quatre types d'hémolyse par l'aspect de la gélose.

    • Bêta hémolyse est indiqué par une zone claire et incolore entourant les colonies. Il y a eu une lyse totale des globules rouges.
    • Alpha hémolyse est indiqué par une petite zone de décoloration verdâtre à brunâtre du support. Ceci est causé par la réduction de l'hémoglobine en méthémoglobine et sa diffusion ultérieure dans le milieu environnant.
    • Hémolyse alpha prime est indiqué par une zone d'hémolyse complète, entourée d'une zone d'hémolyse partielle, un halo rose. Ce motif peut être plus facile à voir si vous grattez la colonie.
    • Hémolyse gamma est indiqué par aucun changement dans le support.

    Limites

    • Les modèles d'hémolyse peuvent varier avec l'atmosphère d'incubation et le type de sang dans le milieu.
    • Certains organismes Staph ne présentent une hémolyse qu'après avoir été réfrigérés après l'incubation.

    Test de coagulase

    Utilisation prévue

    Se différencie Staphylococcus aureus d'autres espèces de Staphylococcus.

    Principe

    Le test de la coagulase détecte la présence de staphylcoagulase libre et liée. Cette enzyme est excrétée de manière extracellulaire par des souches humaines de Staphe. aureus. Le mécanisme d'action est inconnu.

    Procédure de test

    1. Décongeler un tube de 0,5 ml de plasma de lapin.
    2. Inoculer une boucle pleine d'organisme dans le tube. Choisissez une colonie bien isolée.
    3. Idéalement, vous devez incuber le tube à 35°C pendant 4 heures en vérifiant toutes les 30 minutes la formation de caillots. Nous les incubons pendant la nuit et les mettons au réfrigérateur jusqu'à la prochaine période de laboratoire avec des résultats comparables.
    4. Vérifiez la formation de caillots.
    5. Jetez le tube dans le conteneur de danger biologique.

    Résultats

    La formation d'un caillot au fond du tube est considérée comme un résultat positif. Le caillot ne bougera pas lorsque vous inclinez le tube. Du plasma non coagulé s'écoulera dans le tube.

    Limites

    • Résistant à la méthicilline Staphe. aureus ont un facteur d'agrégation réduit.
    • Ne pas secouer ou agiter le tube car cela pourrait briser le caillot.
    • Certaines souches de staphylocoques produisent de la fibrolysine après une incubation prolongée à 35 °C qui peut briser le caillot et donner un faux négatif. Incuber le tube pendant la nuit à température ambiante si vous n'obtenez pas de caillot en 4 heures.
    • Certaines autres espèces de staphylocoques rarement rencontrées sont également coagulase positive par la méthode du tube.

    Tests biochimiques pour les organismes streptocoques

    Tableau 3 : Brève description des tests biochimiques pour les organismes streptocoques.

    Test Mode d'emploi Résultats probables
    BH Supports d'entretien général pour les streptocoques Déterminer la macromorphologie
    Coloration de Gram Pour confirmer la pureté de la culture Les staphylocoques et les streptocoques sont à Gram positif Les entériques sont à Gram négatif
    Norme McFarland Diluer votre organisme dans un tube d'eau stérile pour obtenir une turbidité équivalente à un test standard de 0,5 McFarland. Tenez votre tube dilué et l'étalon de test McFarland 0,5 contre la carte de référence McFarland à lignes noires pour évaluer avec précision la turbidité.
    Optochine
    Bacitracine
    SXT
    Utilisez votre étalon McFarland 0,5 pour tamponner la moitié de la surface d'une plaque de gélose au sang. Placer uniformément un disque de chaque disque sur la surface de la gélose écouvillonnée. Toute zone d'inhibition autour du disque de bacitracine indique une S. pyogenes. Voir résultats probables tableau 4 ci-dessous.
    Hémolyse Strie l'autre moitié de la plaque pour vérifier l'hémolyse. Poignarder dans la surface de la gélose à la dernière partie de votre strie. Incuber 24h au CO2. La bêta-hémolyse est indicative de S. pyogenes et S. agalactiae (parfois). Voir résultats probables tableau 4 ci-dessous.
    Tolérance au sel Inoculer légèrement le bouillon. Boucher sans serrer et incuber pendant 24 à 48 heures dans du CO2. Changement de couleur jaune indiquant Enterococcus faecalis. Voir résultats probables tableau 4 ci-dessous.
    Bile Esculine Rayer la surface de l'inclinaison. Laissez le capuchon desserré. Incuber 24 à 48 heures au CO2. Le noircissement de la gélose indique S. bovis et S. faecalis. Voir résultats probables tableau 4 ci-dessous.

    Tableau 4 : Résultats probables pour les organismes streptocoques

    Streptococcus agalactiae Streptocoque bovis Streptococcus faecalis Streptocoque mutant Streptocoque pyogène
    Macromorphologie Moyen Repérer Moyen Repérer Petit
    FTM Anaérobie facultative Anaérobie facultative Anaérobie facultative Anaérobie facultative Anaérobie facultative
    Motilité Immobile Immobile Immobile Immobile Immobile
    catalase Négatif Négatif Négatif Négatif Négatif
    Oxydase Négatif Négatif Négatif Négatif Négatif
    Optochine Résistant Résistant Variable Résistant Résistant
    Bacitracine Variable Résistant Résistant Résistant Sensible
    SXT Résistant Variable Variable Variable Résistant
    Hémolyse Hémolyse gamma Alpha Hémolyse Alpha Hémolyse Hémolyse gamma Bêta hémolyse
    Tolérance au sel Variable Négatif Positif Négatif Négatif
    Bile Esculine Négatif Variable Positif Positif Négatif

    Sensibilité bacitracine/SXT

    Utilisation prévue

    Les disques différentiels de bacitracine sont utilisés pour identifier de manière présumée les streptocoques bêta-hémolytiques du groupe A des autres streptocoques bêta-hémolytiques. La combinaison de la sensibilité SXT augmente la précision des résultats.

    Principe

    La bacitracine est un antibiotique isolé de Bacillus subtilis. Il inhibe la synthèse de la paroi cellulaire principalement en inhibant la biosynthèse du peptidoglycane. SXT inhibe le métabolisme du folate qui interfère avec la synthèse de l'ADN bactérien. Les streptocoques bêta-hémolytiques du groupe A sont plus sensibles à la bacitracine que les autres streptocoques bêta-hémolytiques.

    Procédure de test

    Le protocole standard a été modifié pour notre laboratoire.

    1. À l'aide d'une boucle, sélectionnez 3 à 4 colonies bien isolées, idéalement à partir d'une culture de 18 à 24 heures. Transférer dans une petite quantité d'eau stérile.
      • Ajustez la turbidité à 0,5 McFarland standard.
    2. Utilisez la procédure décrite dans les tests de sensibilité aux antimicrobiens pour tamponner toute la plaque pour obtenir une croissance confluente.
    3. Divisez visuellement la plaque en tiers, placez une bacitracine et du SXT dans leur section de la plaque. À l'aide de pinces stériles ou d'un écouvillon, appuyez légèrement mais fermement les disques sur la surface de la gélose pour les faire adhérer.
      • Enregistrez l'autre section pour le disque optochin.
    4. Retourner les plaques et les incuber pendant 18-24 heures à 35°C dans 5-10% CO2.
    5. Incuber encore 24 heures si les résultats sont négatifs.

    Résultats

    • Toute zone d'inhibition autour du disque est considérée comme sensible (S).
    • Aucune zone d'inhibition avec croissance jusqu'au disque n'est considérée comme une résistance (R).

    Ce tableau est tiré de MacFaddin, Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria.

    Bacitracine SXT Identifiant présomptif
    S R Streptocoques du groupe A
    R R Streptocoques du groupe B
    R S Pas les streptocoques du groupe A ou B
    S S Exclure le groupe A ou B avec des tests sérologiques

    Limites

    • Seuls les streptocoques bêta-hémolytiques doivent être testés.
    • Bien que ce test soit précis, il n'est pas très spécifique. D'autres tests biochimiques ou sérologiques sont nécessaires pour une identification précise.
    • La croissance doit être confluente. Une croissance trop faible pourrait faire apparaître certains streptocoques non du groupe A sensibles à la bacitracine.

    Hémolyse - Gélose au sang

    Utilisation prévue

    La gélose au sang est utilisée pour favoriser la croissance d'organismes exigeants et pour déterminer le type d'hémolyse (destruction des parois des globules rouges) qu'un organisme produit.

    Principe

    La gélose au sang est un milieu riche qui a été complété avec du sang frais de 5 à 10 %. La réponse hémolytique peut dépendre du type de sang. Le sang de mouton est couramment utilisé, mais certains organismes nécessitent du sang de lapin ou de bovin.

    Procédure de test

    1. Strier une plaque de gélose au sang pour l'isolement.
      • Facultatif : faites votre dernière série avec une aiguille et piquez dans la gélose. Cela donne généralement des zones de bêta-hémolyse claires et fiables et est particulièrement important pour voir les effets de la streptolysine O qui est labile à l'oxygène. Voir page 84 du manuel Difco/BBL.
    2. Incuber les plaques à 37°C pendant 24-48 heures. Les organismes streptococciques doivent être incubés dans le CO2 incubateur.
      • La plaque aura une couleur rouge brunâtre après 48 heures.

    Résultats

    On peut différencier quatre types d'hémolyse par l'aspect de la gélose.

    • Bêta hémolyse est indiqué par une zone claire et incolore entourant les colonies. Il y a eu une lyse totale des globules rouges.
    • Alpha hémolyse est indiqué par une petite zone de décoloration verdâtre à brunâtre du support. Ceci est causé par la réduction de l'hémoglobine en méthémoglobine et sa diffusion ultérieure dans le milieu environnant.
    • Alpha prime hemolysis is indicated by a zone of complete hemolysis, surrounded by a zone of partial hemolysis, a pink halo. This pattern can be easier to see if you scrape off the colony.
    • Gamma hemolysis is indicated by no change in the media.

    Limites

    • The patterns of hemolysis can vary with the incubation atmosphere and the type of blood in the media.
    • Some Staph organisms will only show hemolysis after they have been refrigerated following incubation.

    Salt Tolerance Broth

    Intended Use

    Salt tolerance broth is intended to differentiate non-beta-hemolytic strains of streptococci.

    Principle of Use

    Brain Heart Infusion (BHI) broth is supplemented with 6.5% sodium chloride and bromcresol purple as a pH indicator. The indicator is included to make reading the test results easier. The broth also includes dextrose. The fermentation of dextrose (glucose) results in the production of acid. This changes the pH of the media causing the media to turn from purple to yellow.

    Test Procedure

    1. Select no more than 2-3 colonies (preferably from an overnight culture) to inoculate a tube of salt tolerance broth.
      • It is important to lightly inoculate the tube otherwise you may get a false positive.
    2. Loosen the cap and incubate aerobically for 24 hours at 37°C.
    3. Continue incubation up to 72 hours if you get a negative result at 24 hours.

    Résultats

    A positive reaction is indicated by obvious turbidity in the media with or without a color change. A negative result is indicated by no growth after 72 hours. Entérocoque spp. typically changes the media color within 24 hours.

    Limites

    • Many staphylococci can grow in media containing 10% salt. Mannitol salt agar has 7.5% salt.
    • Salt tolerance media was intended to differentiate catalase negative gram-positive cocci. Be sure to perform a catalase test before you proceed with the salt tolerance broth test.
    • Other species of catalase negative gram-positive organisms can grow in this media.

    Biochemical Tests for Enteric Organisms

    Table 5: Brief Description of Biochemical Tests for Enteric Organisms.

    Test Brief Instructions Probable Results
    TSA General Maintenance Media for Staphs Determine macromorphology
    Gram Stain To confirm culture purity Staphs are Gram positive
    McFarland Standard Dilute your organism in a tube of sterile water to obtain a turbidity equivalent to a 0.5 McFarland test standard. Hold your diluted tube and the 0.5 McFarland test standard against the black-lined McFarland reference card to accurately rate the turbidity.
    Mac Streak for isolation. Incubate 24-48 hrs at 37°C. See probable results table below.
    EMB Streak for isolation. Incubate 24-48 hrs at 37°C. See probable results table below.
    Citrate Streak surface only. Incubate loosely-capped 24-48hrs at 37°C. See probable results table below.
    TSI With a needle pick the center of a well isolated colony. Stab the center of the tube to within 3-5 mm of the bottom. Withdraw the needle and lightly streak the surface of the slant. Incubate for 24 hrs at 37°C. See probable results table below.
    Urée Heavily inoculate a tube of urea broth. Shake tube to distribute organisms. Incubate for 24-48 hrs at 37°C.
    Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Salmonelle typhimurium Shigella flexneri
    Macromorphology Creamy/Tan Medium Mucoid/Tan Medium Translucent Diffusible Translucent Diffusible Creamy/Tan Medium Creamy/Tan Medium
    FTM Facultative Anaerobe Facultative Anaerobe Facultative Anaerobe Strict Aerobe Facultative Anaerobe Facultative Anaerobe
    Motility Motile Non Motile Motile Motile Motile Non Motile
    catalase Positif Positif Positif Positif Positif Positif
    Oxidase Négatif Négatif Négatif Positif Négatif Négatif
    Mac Pink/Purple w/ precipitate Purple/Yellow w/ precipitate Colorless Yellow Media Colorless Yellow Media Colorless Yellow Media Colorless Yellow Media
    EMB Black w/Green Metallic Sheen Purple maybe Green Metallic Sheen Colorless or Pink Colorless or Pink Colorless or Pink Colorless or Pink
    Citrate Négatif Variable Négatif Positif Positif Négatif
    TSI Yellow Slant
    Yellow Butt Gas
    Yellow Slant
    Yellow Butt Gas
    Yellow Slant
    Yellow Butt Gas, H2S
    Unchanged Slant & Butt Red Slant
    Yellow Butt Gas, H2S
    Unchanged Slant
    Yellow Butt
    Urée Négatif Variable Positif Négatif Négatif Négatif

    Simmons Citrate Agar Slant

    Simmons Citrate Agar Slant

    Principe

    Used for the differentiation and identification of Enterobacteriaceae on the basis of citrate utilization, citrate being the sole carbon source.

    But

    Colonies capable of utilizing citrate as a carbon source produce a local increase in pH, changing the color of the medium from green to blue. Only citrate positive organisms will grow on this medium.

    Test Procedure

    1. Inoculate the organism directly onto the surface of a Citrate slant.
    2. Incubate aerobically at 35-37°C.
    3. Examine for growth and color change after 18-24 hours of incubation.

    Interpretations

    Good growth with the medium color turning blue indicative of Enterobacter aerogenes et Salmonella choleraesuis.

    Eosin Methylene Blue (EMB) Agar

    Eosin Methylene Blue (EMB) Agar

    Principe

    A differential plating medium for the detection & isolation of the gram-negative enteric bacteria.


    Voir la vidéo: Microbiologie chapitre 1: le monde microbien résume (Mai 2022).