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Comment insérer cas9 dans des cellules animales ?

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Comment cas9 a-t-il pu être inséré dans des cellules par des chercheurs cherchant à modifier un génome ? J'imagine que pour l'ingénierie des systèmes bactériens, vous pourriez simplement mettre la région codante cas9 dans un vecteur d'expression, mais est-ce ainsi que cela se fait également pour les cellules eucaryotes ?


Si vous parlez de la fonctionnalité nucléase de Cas9, alors vous n'ajoutez pas le gène Cas9 dans le génome, vous le transfectez sur un plasmide. Habituellement, soit une certaine forme de perméabilisation est effectuée sur les cellules, soit la construction est insérée dans un vecteur viral afin de transfecter les cellules en culture tissulaire. Chez les animaux multicellulaires, vous devrez utiliser la voie du vecteur viral comme cela devrait être fait avec n'importe quelle technique de thérapie génique. Addgene est un référentiel de plasmides à but non lucratif qui contient de nombreuses constructions CRISPR/Cas9 qui ont été développées, et ils ont une excellente ressource sur leur site Web.

Vous ne voudriez pas vraiment que Cas9 soit actif dans la cellule une fois qu'il a fait son travail, car vous augmentez votre probabilité de succès hors cible. La cible ne devrait de toute façon pas être dans le génome si l'événement de ciblage s'est produit, car vous avez soit substitué un autre morceau d'ADN, soit vous avez coupé l'ADN et les mécanismes de réparation de l'ADN ont introduit des nucléotides aléatoires afin de réparer la cassure double brin.

Les cellules eucaryotes, pour la plupart, ne peuvent pas conserver les plasmides. Le gène Cas9 sera transcrit avec l'ARN guide. Le complexe protéine/ARN résultant cible la séquence d'intérêt et effectue une coupe. Lorsque la cellule se réplique, le plasmide sera probablement perdu, mais les cellules filles hériteront de la modification génomique effectuée par l'événement de ciblage.

Si vous cherchez à insérer un gène différent sur le site cible, disons un journaliste dans le génome, vous co-transfectez alors un morceau linéaire d'ADN avec des bras d'homologie autour du site coupé afin que ce donneur soit inséré via une réparation de rupture homologue.

L'une des constructions Cas9 qui a été développée a désactivé l'activité nucléase, de sorte que le complexe Cas9/ARN finit par agir comme une protéine de liaison pour supprimer l'activité que vous cherchez à étudier sans réellement supprimer ou remplacer le gène. Dans ce cas, vous pouvez chercher à insérer la cassette Cas9, auquel cas vous utiliserez un événement de recombinaison comme vous le feriez avec tout autre type d'incorporation dans le génome.


Comment fonctionne CRISPR Cas9 ?

Il peut être utilisé pour insérer des séquences génétiques dans un locus de choix. Pour comprendre comment vous devez vraiment comprendre le ciblage des gènes par recombinaison homologue, et pour comprendre cela, vous devez comprendre la recombinaison homologue. Vous pouvez trouver du matériel pour couvrir cela plus en profondeur en ligne, mais je vais essayer d'expliquer au niveau le plus simple.

Les dommages à l'ADN sont assez graves pour les cellules, en particulier les cassures double brin (DSB) où les deux brins de la double hélice sont divisés. Les cellules ont donc vraiment besoin de les réparer, et en fait, elles ont deux mécanismes pour le faire :

a) Jonction d'extrémités non homologues - où ils prennent simplement les deux bits cassés et les assemblent - ce n'est pas précis et peut souvent conduire à des insertions/suppressions avec une éventuelle mutation de décalage de trame.

b) La recombinaison homologue - c'est lorsque la cellule utilise le chromosome homologue comme modèle pour fixer le DSB. Les détails de son fonctionnement ne sont pas importants, mais comprenez simplement que la cellule recherche des séquences homologues en amont et en aval du DSB (bras d'homologie 5' et 3' respectivement) et fait correspondre cela aux bras d'homologie dans l'ADN matrice et copie sur tout entre eux pour combler le vide et réparer le DSB.

Ce que cela signifie alors, c'est que nous pouvons exploiter ce système pour insérer des gènes simplement en insérant une fausse matrice d'ADN pour que l'ADN brisé puisse l'utiliser comme copie de réparation. Tout ce dont nous avons besoin, ce sont des bras d'homologie 5' et 3', mais avec le gène que nous voulons entre eux. Ceci est connu sous le nom de ciblage génétique :

Si vous avez un marqueur de sélection (par exemple, la résistance aux antibiotiques), nous pouvons sélectionner des cellules qui ont absorbé le gène à cet endroit. Mais en réalité, le système tel qu'il est repose sur l'attente que les DSB se produisent par hasard.

C'est là qu'intervient le système CRISPR/Cas9. Comme vous le dites, il s'agit essentiellement d'une paire moléculaire programmable de ciseaux moléculaires qui peut faire un DSB n'importe où. Cela se fait simplement en réalisant un ARN guide complémentaire du locus où vous souhaitez effectuer la coupe. Donc, dans l'ensemble, si vous injectez l'ARN guide avec l'enzyme cas9, vous obtiendrez un DSB là où vous le souhaitez. Vous devez également injecter un modèle de réparation de recombinaison homologue avec des bras d'homologie à insérer dans votre gène lorsque le DSB essaie de se réparer.


Incidemment, vous pouvez également utiliser le système CRISPR/Cas9 en mode knock-out au lieu d'un mode d'insertion de gène. Ici, vous suivez les mêmes étapes mais vous n'avez pas de modèle de réparation. Au lieu de cela, vous voulez que la réparation se produise par une jonction d'extrémités non homologues pour créer des mutations indel, et donc par décalage de cadre. Cela créera un codon d'arrêt prématuré et le produit d'ARNm sera dégradé de sorte que vous avez assommé ce gène.


Édition de gènes CRISPR-Cas9 : vérifiez trois fois, coupez une fois

Carte couleur bayésienne illustrant le mouvement des particules Cas9 dans différentes régions d'un noyau cellulaire de mammifère. Le rouge/orange indique un mouvement plus rapide et le bleu indique un mouvement plus lent. Le mouvement de Cas9 est généralement plus restreint dans les régions silencieuses/faiblement exprimées du génome connues sous le nom d'hétérochromatine. Crédit : UC Berkeley/HHMI

Deux nouvelles études de l'Université de Californie à Berkeley devraient donner aux scientifiques qui utilisent CRISPR-Cas9 pour l'ingénierie du génome une plus grande confiance qu'ils ne modifieront pas par inadvertance le mauvais ADN.

La technique d'édition de gènes, créée par la biochimiste de l'UC Berkeley Jennifer Doudna et sa collègue européenne Emmanuelle Charpentier, a pris d'assaut les communautés de recherche et de clinique comme un moyen facile et peu coûteux d'apporter des modifications précises à l'ADN afin de désactiver des gènes, de corriger des troubles génétiques ou insérer des gènes mutés dans des animaux pour créer des modèles de maladies humaines.

Les deux nouveaux rapports du laboratoire de Doudna et celui de Robert Tjian, collègue de l'UC Berkeley, montrent de manière beaucoup plus détaillée comment la protéine Cas9 parcourt des milliards de paires de bases dans une cellule pour trouver la bonne séquence d'ADN, et comment Cas9 détermine s'il faut se lier ou se lier. et coupé, initiant ainsi l'édition de gènes. Sur la base de ces expériences, Cas9 semble avoir au moins trois moyens de vérifier pour s'assurer qu'il trouve le bon ADN cible avant de prendre l'étape irrévocable de faire une coupe.

"CRISPR-Cas9 a évolué pour un ciblage précis de l'ADN, et nous comprenons maintenant la base moléculaire de son activité de recherche et de clivage, qui aide à limiter l'édition d'ADN hors cible", a déclaré Doudna, chercheur au Howard Hughes Medical Institute à l'UC Berkeley et professeur de biologie moléculaire et cellulaire et de chimie. Tjian est président du Howard Hughes Medical Institute et professeur de biologie moléculaire et cellulaire à l'UC Berkeley.

Les études illustrent également à quel point CRISPR/Cas9 fonctionne dans les cellules humaines et animales - les eucaryotes - même si "la technique a été inventée par des bactéries pour se protéger de la grippe", a déclaré Doudna.

CRISPR-Cas9 est un hybride de protéine et d'ARN - le cousin de l'ADN - qui fonctionne comme un système efficace de recherche et de capture chez les bactéries. Il est apparu comme un moyen de reconnaître et de tuer les virus, mais Doudna et Charpentier ont réalisé qu'il pourrait également bien fonctionner dans d'autres cellules, y compris les humains, pour faciliter l'édition du génome. La protéine Cas9, obtenue à partir de la bactérie Streptococcus pyogenes, fonctionne avec un ARN "guide" qui cible une séquence complémentaire d'ADN de 20 nucléotides. Une fois que l'ARN identifie une séquence correspondant à ces nucléotides, Cas9 coupe l'hélice d'ADN double brin.

Une étude, publiée dans le numéro du 13 novembre de Science, ont suivi les molécules d'ARN Cas9 à travers le noyau des cellules de mammifères alors qu'elles parcouraient rapidement l'ensemble du génome pour trouver et lier uniquement la région ciblée et aucune autre.

L'enzyme Cas9 doit fléchir et se plier pour se lier à l'ARN guide (orange). Une fois que le complexe Cas9-ARN trouve son ADN cible (rouge), la région coupante de Cas9 (jaune) se met en place par rapport à son partenaire (bleu) uniquement lorsque l'ARN et l'ADN correspondent correctement. Ce n'est qu'alors que l'enzyme coupe l'ADN double brin. Ces mouvements détaillés ont été révélés par des expériences de fluorescence rapportées dans un La nature papier du laboratoire Doudna. Crédit : Sam Sternberg/UC Berkeley

"C'est fou que le complexe Cas9 parvienne à balayer le vaste espace des génomes eucaryotes", a déclaré l'étudiant diplômé Spencer Knight, premier auteur du Science papier.

Des études antérieures avaient suggéré qu'il existe de nombreuses régions d'ADN d'apparence similaire que Cas9 pourrait lier et couper, ce qui pourrait limiter son utilité si la précision était importante. Ces régions hors cible peuvent partager aussi peu que quatre ou cinq nucléotides avec l'amorce de 20 nucléotides, juste assez pour que Cas9 les reconnaisse.

"Il y a beaucoup de liaisons hors cible par Cas9, mais nous avons constaté que ces interactions sont très brèves - de quelques millisecondes à quelques secondes - avant que Cas9 ne passe", a-t-il déclaré.

Parce que ces liaisons exploratoires - peut-être jusqu'à 300 000 d'entre elles - sont souvent de très courte durée, quelques milliers de complexes CRISPR-Cas9 peuvent parcourir l'ensemble du génome pour trouver un tronçon d'ADN ciblé. Cas9 doit également reconnaître une courte séquence d'ADN de trois paires de bases immédiatement après la séquence d'amorce, appelée PAM, qui apparaît environ 300 millions de fois dans le génome humain.

"Si Cas9 se déplaçait pendant des dizaines de secondes ou de minutes sur chaque site hors cible, il ne serait jamais, jamais capable de trouver une cible et de couper en temps opportun", a déclaré Knight.

Le point de contrôle final de Cas9

L'autre étude, publiée en ligne le 28 octobre dans La nature, a montré qu'une fois que Cas9 se lie à une région d'ADN, il effectue une autre vérification avant que deux sections distantes du complexe protéique Cas9 ne se rejoignent, comme les lames d'un ciseau, pour aligner avec précision les sites actifs qui coupent l'ADN double brin.

"Nous avons découvert que Cas9 guidé par l'ARN peut lier très étroitement certaines séquences d'ADN hors cible, qui diffèrent de la cible correcte par quelques mutations seulement. Étonnamment, cependant, la région de Cas9 qui effectue la coupe est inhibée en raison de l'imparfait Mais lorsque l'ADN correspondant correctement est localisé, Cas9 subit un grand changement structurel qui libère cette inhibition et déclenche la coupure de l'ADN », a déclaré le premier auteur Samuel Sternberg, qui a récemment obtenu son doctorat. à l'UC Berkeley. Il a pu observer ces changements en utilisant une version marquée par fluorescence du complexe Cas9.

"Nous pensons que ce changement structurel est le dernier point de contrôle, ou étape de relecture, de la réaction de ciblage de l'ADN", a-t-il déclaré. "Tout d'abord, Cas9 reconnaît un court segment d'ADN à côté de la cible - le PAM - puis l'ADN cible est mis en correspondance avec l'ARN guide via l'appariement de bases Watson-Crick. Enfin, lorsqu'une correspondance parfaite est identifiée, la dernière partie du la protéine se met en place pour permettre la coupe et lancer l'édition du génome."

Une protéine Cas9 plus petite d'une espèce de bactérie différente, Staphylococcus aureus, exploite probablement la même stratégie pour améliorer la précision du ciblage de l'ADN, suggérant que "cette caractéristique importante a été préservée tout au long de l'évolution", a-t-il ajouté.

"C'est une bonne nouvelle, car cela suggère que vous avez plus d'un point de contrôle pour assurer une liaison Cas9 correcte", a déclaré Knight. "Il n'y a pas seulement une régulation de séquence, il y a aussi une régulation temporelle : il doit s'engager avec l'ADN et se garer assez longtemps pour pouvoir réellement se réarranger et couper."

Les découvertes de Doudna, Tjian et de leurs équipes mettent en lumière la base moléculaire des effets hors cible lors des applications d'édition du génome et pourraient guider la conception future de variantes Cas9 plus précises.


CRISPR/Cas9 : BIOLOGIE, MÉCANISME D'ACTION ET DÉFIS

La technique CRISPR/Cas9 a non seulement montré une croissance considérable dans la recherche scientifique, mais elle a également attiré beaucoup d'attention en tant qu'outil prometteur d'édition de gènes pour le cancer, les troubles génétiques et les bactéries pathogènes. Sur les 13469 articles qui présentent le mot « 56 a été l'équivalent, environ 5665 articles ont été publiés dans PubMed de 2018 à aujourd'hui.

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Le domaine en plein essor de la technologie CRISPR/Cas a dépassé les autres outils d'édition de gènes en raison de sa facilité de manipulation et de son faible coût.

CRISPR est la forme abrégée du nom "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats". La protéine CRISPR Associated est abrégée en protéine Cas. Par conséquent, la technique est appelée technologie CRISPR/Cas en abrégé.

Les systèmes CRISPR/Cas se produisent naturellement dans les bactéries et les archées (procaryotes) pour acquérir une immunité contre les infections virales et les plasmides. Plus tard, les scientifiques ont commencé à adopter ce système pour modifier les gènes des procaryotes ainsi que des eucaryotes.

Le premier signe du système CRISPR/Cas a été découvert par un groupe de recherche japonais en 1987. Ils ont identifié un modèle de séquences répétées courtes entrecoupées de « espaceurs » courts et non répétitifs dans Escherichia coli génome. En 2012, deux scientifiques (Doudna et Charpentier) ont programmé le système CRISPR/Cas9 pour cliver des séquences d'ADN spécifiques. Cela a conduit à l'émergence de CRISPR/Cas9 comme un outil d'édition de gènes prometteur.

Le système CRISPR/Cas peut être classé en deux classes : Classe1 et Classe2. Les systèmes CRISPR/Cas de classe 1 utilisent un complexe multi-protéines Cas, tandis que les systèmes CRISPR/Cas de classe 2 réalisent une seule protéine Cas. Deux autres classes sont divisées en six types en fonction de la présence de gènes de signature spécifiques.

La technique CRISPR/Cas9 largement utilisée appartient au système CRISPR/Cas de classe 2 de type II. Le système CRISPR/Cas9 est naturellement présent dans Streptocoque pyogène bactérie comme système immunitaire adaptatif pour perturber le virus et le plasmide qui envahissent les bactéries. Dans ce système, une courte séquence d'ADN étranger (virus ou plasmide) est intégrée dans le génome de la bactérie pour créer une « identité » afin de reconnaître des invasions similaires avant leurs infections futures. Une fois qu'un virus similaire envahit, les bactéries codent pour un brin d'acide ribonucléique (ARN) complémentaire d'« identité » qui peut se lier à la séquence d'ADN complémentaire du virus puis la cliver.

Le système CRISPR/Cas9 se compose de trois composants : ARNr (ARN CRISPR), ARN tracr (ARN transactivant CRISPR) et protéine Cas9. Cette protéine Cas9 présente une activité hélicase (dérouler l'ADN double brin) ainsi qu'une activité nucléase (cliquer le brin d'ADN). Dans le système bactérien CRISPR/Cas9, l'ARN guide (gRNAà crRNA + tracrRNA) dirige la protéine Cas9 qui fonctionne comme une enzyme endonucléase d'ADN pour cliver les brins d'ADN viral.

Figure 1 : Classification du système CRISPR/Cas

Au lieu de deux molécules d'ARN distinctes, les chercheurs ont synthétisé une molécule d'ARN (sgRNA-single guide RNA) qui peut être utilisée comme une molécule similaire à crRNA+tracrRNA. Il a simplifié le système CRISPR/Cas9 à trois composants en un système à deux composants (sgRNA +Cas9).

MÉCANISME D'ACTION

Le mécanisme de défense du système CRISPR/Cas9 chez les bactéries peut être divisé en trois phases :

Chaque phase est décrite ci-dessous avec un schéma.

Après l'infection virale, l'opéron cas produit (transcription suivie de traduction) le complexe protéique cas1-cas2 qui peut identifier la séquence protospacer/espaceur (« identité ») de l'ADN viral et l'intégrer à la puce CRISPR flanquée de séquences répétées.

Plus tard, le gène tracr et la matrice CRISPR transcrivent (convertissent le gène en molécule d'ARN respective) respectivement le tracrRNA et le pré-crRNA tandis que le gène cas9 transcrit et traduit (convertit la molécule d'ARN en protéine respective) en protéine cas9.

Figure 2 : Acquisition de l'espaceur du système CRISPR/Cas9

Le tracrRNA s'hybride à la répétition pré-crRNA. Puis tracrRNA : le duplex pré-crRNA se lie à la protéine cas9. De plus, le complexe recrute l'enzyme RNaseIII qui clive le pré-ARNr au niveau de la répétition. Enfin, une nucléase inconnue coupe la partie dérivée de la répétition 5 'de l'ARNr en laissant une séquence d'espacement de 20 nucléotides pour la phase finale. Cela forme le complexe CRISPR/Cas9 final pour les interférences.

Figure 3 : traitement de l'ARNr du système CRISPR/Cas9

Le Cas9 du complexe effecteur identifie la séquence d'ADN cible grâce à la reconnaissance PAM (Protospacer Adjacent Motif) qui se localise dans le brin d'ADN non cible (La séquence PAM reconnue par Streptocoque pyogène est 5’NGG 3′). La séquence d'espacement de 20 nucléotides de long de l'ARNc mature se lie au brin d'ADN cible dans l'ADN viral. Il permet à la protéine cas9 d'activer ses deux domaines de nucléase, HNH et RuvC. Ces deux domaines HNH et RuvC clivent respectivement le brin d'ADN cible et le brin d'ADN non cible du virus, en générant une cassure double brin franche de 3 paires de bases devant le PAM. Cela conduit à la destruction du génome viral.

Figure 4 : Interférence du système CRISPR/Cas9

Les bactéries utilisent le système CRISPR/Cas9 pour les protéger des invasions. Néanmoins, le même système peut être exploité pour éditer le génome des mammifères, y compris les humains. Contrairement aux bactéries, il donne lieu à des cassures double brin dans l'ADN qui sont ensuite réparées soit par une jonction d'extrémités non homologues, soit par un mécanisme de réparation dirigé par homologie dans les cellules de mammifères. Cela a attiré beaucoup d'attention de la communauté scientifique pour être utilisé dans cette technique de pointe pour éradiquer les maladies humaines telles que les troubles génétiques du sang, les maladies neurodégénératives et les cancers. À ce jour, plusieurs essais cliniques ont été recrutés pour utiliser la technique CRISPR/Cas9 pour traiter le cancer et la bêta-thalassémie selon la base de données ClinicalTrials.gov.

DÉFIS

Même si le système CRISPR/Cas9 est très prometteur pour traiter les maladies humaines, il est confronté à des défis techniques.

Le système CRISPR/Cas9 est naturellement présent dans Streptocoque pyogène bactérie nocive pour la santé humaine. Une fois qu'il est livré aux cellules humaines, le corps humain peut créer une immunogénicité (provoquant une réponse immunitaire dans le corps humain par substance) qui fait échouer le système CRISPR/Cas9 à l'intérieur du corps.

Les chercheurs utilisent souvent des vecteurs viraux associés à Adeno (AAV) pour délivrer le système CRISPR/Cas in vivo. Comme la protéine Cas9 est de grande taille, l'empaquetage dans le vecteur AAV est un véritable défi. Par conséquent, les chercheurs devraient soit découvrir des vecteurs alternatifs qui ont une faible immunogénicité, soit des variantes cas9 qui sont de plus petite taille pour l'emballage.

Un autre problème est que le système CRISPR/Cas9 provoque des effets hors cible en coupant le mauvais morceau d'ADN. Par conséquent, il est pratique de découvrir des variantes de cas9 qui ont une large compatibilité PAM et une spécificité d'ADN élevée pour éviter cet obstacle.

De plus, cette technique puissante doit être utilisée de manière responsable et prudente, non seulement pour profiter à toute l'humanité, mais aussi pour éviter les fautes qui peuvent conduire à de graves problèmes éthiques dans la société humaine.


Édition de gènes CRISPR-Cas9 : vérifiez trois fois, coupez une fois

Deux nouvelles études de l'UC Berkeley devraient donner aux scientifiques qui utilisent CRISPR-Cas9 pour l'ingénierie du génome une plus grande confiance qu'ils ne modifieront pas par inadvertance le mauvais ADN.

La technique d'édition de gènes, créée par la biochimiste de l'UC Berkeley Jennifer Doudna et sa collègue, Emmanuelle Charpentier, directrice de l'Institut Max Planck de biologie des infections à Berlin, a pris d'assaut la recherche et les communautés cliniques comme un moyen facile et peu coûteux d'apporter des changements précis. dans l'ADN afin de désactiver des gènes, de corriger des troubles génétiques ou d'insérer des gènes mutés dans des animaux pour créer des modèles de maladie humaine.

Les deux nouveaux rapports du laboratoire de Doudna et celui de Robert Tjian, collègue de l'UC Berkeley, montrent de manière beaucoup plus détaillée comment la protéine Cas9 parcourt des milliards de paires de bases dans une cellule pour trouver la bonne séquence d'ADN, et comment Cas9 détermine s'il faut se lier ou se lier. et coupé, initiant ainsi l'édition de gènes. Sur la base de ces expériences, Cas9 semble avoir au moins trois moyens de vérifier pour s'assurer qu'il trouve le bon ADN cible avant de prendre l'étape irrévocable de faire une coupe.

"CRISPR-Cas9 a évolué pour un ciblage précis de l'ADN, et nous comprenons maintenant la base moléculaire de son activité de recherche et de clivage, qui aide à limiter l'édition d'ADN hors cible", a déclaré Doudna, chercheur au Howard Hughes Medical Institute à l'UC Berkeley et professeur de biologie moléculaire et cellulaire et de chimie. Tjian est président du Howard Hughes Medical Institute et professeur de biologie moléculaire et cellulaire à l'UC Berkeley.

Les études illustrent également à quel point CRISPR/Cas9 fonctionne dans les cellules humaines et animales – les eucaryotes – même si « la technique a été inventée par des bactéries pour se protéger de la grippe », a déclaré Doudna.

CRISPR-Cas9 est un hybride de protéine et d'ARN - le cousin de l'ADN - qui fonctionne comme un système efficace de recherche et de capture chez les bactéries. Il est apparu comme un moyen de reconnaître et de tuer les virus, mais Doudna et Charpentier ont réalisé qu'il pourrait également bien fonctionner dans d'autres cellules, y compris les humains, pour faciliter l'édition du génome. La protéine Cas9, obtenue à partir des bactéries Streptocoque pyogène, fonctionne avec un ARN « guide » qui cible une séquence complémentaire d'ADN de 20 nucléotides. Une fois que l'ARN identifie une séquence correspondant à ces nucléotides, Cas9 coupe l'hélice d'ADN double brin.

Une étude, publiée dans le numéro du 13 novembre de Science, ont suivi les molécules d'ARN Cas9 à travers le noyau des cellules de mammifères alors qu'elles parcouraient rapidement l'ensemble du génome pour trouver et lier uniquement la région ciblée et aucune autre.

"C'est fou que le complexe Cas9 parvienne à balayer le vaste espace des génomes eucaryotes", a déclaré l'étudiant diplômé Spencer Knight, premier auteur du Science papier.

Des études antérieures avaient suggéré qu'il existe de nombreuses régions d'ADN d'apparence similaire que Cas9 pourrait lier et couper, ce qui pourrait limiter son utilité si la précision était importante. Ces régions hors cible peuvent partager aussi peu que quatre ou cinq nucléotides avec l'amorce de 20 nucléotides, juste assez pour que Cas9 les reconnaisse.

"Il y a beaucoup de liaisons hors cible par Cas9, mais nous avons constaté que ces interactions sont très brèves - de quelques millisecondes à quelques secondes - avant que Cas9 ne passe", a-t-il déclaré.

Étant donné que ces liaisons exploratoires - peut-être jusqu'à 300 000 d'entre elles - sont souvent de très courte durée, quelques milliers de complexes CRISPR-Cas9 peuvent parcourir l'ensemble du génome pour trouver un tronçon d'ADN ciblé. Cas9 doit également reconnaître une courte séquence d'ADN de trois paires de bases immédiatement après la séquence d'amorce, appelée PAM, qui apparaît environ 300 millions de fois dans le génome humain.

"Si Cas9 se déplaçait pendant des dizaines de secondes ou de minutes sur chaque site hors cible, il ne serait jamais, jamais capable de trouver une cible et de couper en temps opportun", a déclaré Knight.

Le point de contrôle final de Cas9

L'autre étude, publiée en ligne le 28 octobre dans La nature, a montré qu'une fois que Cas9 se lie à une région d'ADN, il effectue une autre vérification avant que deux sections distantes du complexe protéique Cas9 ne se rejoignent, comme les lames d'un ciseau, pour aligner avec précision les sites actifs qui coupent l'ADN double brin.

« Nous avons découvert que Cas9 guidé par l'ARN peut lier très étroitement certaines séquences d'ADN hors cible, qui diffèrent de la cible correcte par quelques mutations seulement. Étonnamment, cependant, la région de Cas9 qui effectue la coupe est inhibée en raison de la correspondance imparfaite. Mais lorsque l'ADN correspondant correctement est localisé, Cas9 subit un grand changement structurel qui libère cette inhibition et déclenche la coupe de l'ADN », a déclaré le premier auteur Samuel Sternberg, qui a récemment obtenu son doctorat. à l'UC Berkeley. Il a pu observer ces changements en utilisant une version marquée par fluorescence du complexe Cas9.

"Nous pensons que ce changement structurel est le dernier point de contrôle, ou étape de relecture, de la réaction de ciblage de l'ADN", a-t-il déclaré. "Tout d'abord, Cas9 reconnaît un court segment d'ADN à côté de la cible - le PAM - puis l'ADN cible est mis en correspondance avec l'ARN guide via l'appariement de bases Watson-Crick. Enfin, lorsqu'une correspondance parfaite est identifiée, la dernière partie de la protéine se met en place pour permettre la coupe et lancer l'édition du génome.

Une protéine Cas9 plus petite d'une espèce différente de bactéries, Staphylococcus aureus, exploite probablement la même stratégie pour améliorer la précision du ciblage de l'ADN, suggérant que "cette caractéristique importante a été préservée tout au long de l'évolution", a-t-il ajouté.

"C'est une bonne nouvelle, car cela suggère que vous avez plus d'un point de contrôle pour assurer une liaison Cas9 correcte", a déclaré Knight. "Il n'y a pas seulement une régulation de séquence, il y a aussi une régulation temporelle : il doit s'engager avec l'ADN et se garer assez longtemps pour pouvoir réellement se réarranger et couper."

Les découvertes de Doudna, Tjian et de leurs équipes mettent en lumière la base moléculaire des effets hors cible lors des applications d'édition du génome et pourraient guider la conception future de variantes Cas9 plus précises.

Les études ont été financées par la National Science Foundation (MCB-1244557) et le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, RB4-06016).

Co-auteurs avec Knight, Doudna et Tjian sur le Science sont Liangqi Xie, Benjamin Guglielmi, Lea Witkowsky, Lana Bosanac et Elisa Zhang de l'UC Berkeley Wulan Deng, Jean-Baptiste Masson et Zhe Liu du Janelia Research Campus, situé à Ashburn, Virginie, du Howard Hughes Medical Institute et Mohamed El Beheiry et Maxime Dahan du Laboratoire Physico-Chimie Curie à l'Institut Curie à Paris, France. Doudna et Tjian sont tous deux membres du Li Ka Shing Biomedical and Health Sciences Center de l'UC Berkeley.

Co-auteurs avec Sternberg et Doudna de la La nature papier sont Benjamin LaFrance et Matias Kaplan de UC Berkeley.

Doudna est directeur de l'Initiative de génomique innovante de l'UC Berkeley et chercheur universitaire au Lawrence Berkeley National Laboratory.

INFORMATIONS CONNEXES


Figure 1 : CRISPR-Cas9 (www.stockadobe.com)

Alors que le rôle des produits biologiques dans le traitement des maladies humaines a considérablement évolué au cours de la dernière décennie, le génie génétique a également évolué. Le génie génétique rationnel pour améliorer les protéines biothérapeutiques est devenu une réalité catalysée par la publication des séquences du génome de plusieurs lignées cellulaires d'ovaires de hamster chinois (CHO). De nouvelles cellules CHO « conceptrices » modulent les modifications post-traductionnelles (PTM) de protéines recombinantes par édition du génome, et il est désormais possible d'inactiver ou de désactiver des gènes de cellules de levure et de mammifère avec précision (au sein d'une paire de bases d'ADN), rapidement et efficacement. À terme, ces techniques seront utilisées dans le développement de protéines thérapeutiques recombinantes rentables.

L'outil d'édition de gènes basé sur des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en grappes bactériennes (CRISPR)–CRISPR-associated protein 9 (Cas9) a considérablement amélioré l'édition du génome, la rendant plus rapide, plus facile, moins coûteuse et plus efficace qu'auparavant. Ce système n'a besoin que d'une protéine et d'une molécule d'ARN pour réaliser le clivage de l'ADN programmé par l'ARN. Cette capacité a permis aux chercheurs de CHO d'élucider la base mécanique derrière la production de protéines de haut niveau et les attributs de qualité des produits (PQA) d'intérêt. Actuellement, l'accent mis sur l'édition de gènes CHO est axé sur l'élargissement de la diversité des produits ainsi que sur le contrôle et l'amélioration de la qualité et des rendements des produits. Bien que l'optimisation de routine de la PTM à travers la «machine» de glycosylation d'une cellule ne soit pas encore une réalité, les chercheurs espèrent éventuellement pouvoir combiner l'expression d'hôtes non mammifères avec une glycosylation d'anticorps de type humain réalisée dans des levures modifiées ou même des plantes.

Mais l'utilisation de l'ingénierie des promoteurs pour obtenir un contrôle transcriptionnel de précision pour la biotechnologie synthétique des cellules CHO pourrait être réalisée dans un proche avenir. De même, l'édition du génome multiplexé (ciblage simultané de plusieurs cibles liées ou non) pourrait permettre l'examen et la manipulation de génomes entiers ou de réseaux de protéines. Ainsi, elle a révolutionné les événements knock-out et knockin et a joué un rôle crucial dans la compréhension des génomes de cellules de mammifères et l'utilisation de levures pour l'ingénierie métabolique. De telles capacités d'édition ont également permis une expression élevée, stable et cohérente de transgènes codant pour des protéines thérapeutiques complexes telles que les anticorps monoclonaux (MAb).

Modifications post-traductionnelles
Les technologies avancées d'édition de gènes telles que CRISPR-Cas9, les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALE) et les outils d'interférence ARN (ARNi) sont complétées par la combinaison du séquençage de nouvelle génération avec la biotechnologie des systèmes pour faciliter de nouvelles améliorations dans le traitement de la glycosylation cellulaire. De tels outils permettront aux ingénieurs de cellules d'apporter des modifications hautement raffinées et ciblées pour accélérer la capacité de traitement des cellules. Cela apportera des améliorations constantes du rendement et de la qualité des cellules ainsi qu'une efficacité accrue des processus, conduisant ainsi à une accessibilité accrue pour les futurs besoins de soins de santé.

Les ingénieurs cellulaires sont témoins d'une prolifération d'outils habilitants alors que les biologistes moléculaires et cellulaires continuent de développer des techniques sophistiquées pour déchiffrer les attributs essentiels à la qualité des produits pharmaceutiques. L'amélioration des profils de glycosylation des produits biologiques améliore la bioactivité et la qualité du produit, et la glycosylation liée à l'azote joue un rôle crucial dans l'efficacité des protéines thérapeutiques. L'efficacité thérapeutique prouvée de nombreuses protéines génétiquement modifiées a stimulé le développement de nouveaux systèmes d'expression optimisés (par exemple, des cellules de mammifères) pour produire des anticorps non fucosylés.

Il devient désormais possible de produire rapidement du matériel pour des études de pharmacologie, de formulation et de toxicologie sans avoir à établir une lignée cellulaire stable. Une telle capacité peut raccourcir les délais de développement de lignées cellulaires stables de plus de six mois à environ trois semaines, permettant ainsi une génération de clones stables au stade de la recherche. Dans le même temps, différents systèmes de production de protéines glyco-optimisées (par exemple, la levure) ont déjà été conçus pour produire les principales étapes de la voie de N-glycosylation humaine et ont ainsi permis de meilleures versions des MAb thérapeutiques.

L'application des outils CRISPR-Cas9 a conduit à des phénotypes multiplexés knock-out. De même, les réalisations à venir avec des (petits) ARN non codants dans les cellules CHO pourraient également soutenir les efforts de génomique fonctionnelle pour améliorer les cellules productrices. Cela élargirait considérablement la liste des cibles d'ingénierie (par exemple, comme obtenu avec l'obinutuzumab, un MAb anti-CD20 humanisé et modifié par glyco-ingénierie, avec des glucides de la région Fc afucosylés en deux et la technologie GlycoMAb, de GlycArt-Roche).

Il n'y a pas si longtemps, les cellules CHO étaient considérées comme des « boîtes noires » parce que les chercheurs ne disposaient pas des informations génomiques de ces cellules. Cela a entravé les efforts visant à comprendre la base moléculaire de la production de haute qualité de protéines recombinantes dans les cellules CHO. Notamment, des progrès impressionnants dans la technologie de culture cellulaire CHO ont été réalisés par des approches empiriques telles que le criblage et l'optimisation des processus, permettant ainsi des rendements élevés (10 g/L et plus). Cependant, de tels rendements ne sont souvent atteints que par certains types de lignées cellulaires, et un degré élevé de variabilité dans les cellules CHO recombinantes nécessite des processus laborieux et coûteux pour sélectionner le meilleur clone pour la production de chaque nouveau candidat thérapeutique.

Les cellules recombinantes traditionnelles sont basées sur l'intégration plasmidique aléatoire d'une cassette d'expression dans le génome de l'hôte. Transgenes are likely to be inserted in heterochromatin regions, which results in very weak gene-expression levels. So a substantial number of clones (generally multiple hundreds to a few thousand) must be screened to find those rare cells with a stably integrated plasmid in highly transcriptionally active chromatin regions (“hotspots”).

Sequencing efforts have resulted in availability of additional genomic sequence data for different CHO cell lines. Moreover, an active effort is underway in the CHO cell-line community to refine the genome assembly and annotation for the Chinese hamster. In the past 20 years, several molecular and cellular biology tools have been developed for targeted-site gene integration for eventually minimizing the randomness of gene insertion and increasing the predictability of high transgene expression.

Édition du génome
First-Generation Genome-Editing Tools: Several recombinases have been used for targeted site approaches, with Cre–saumon fumé and Flp–FRT being the most commonly used. Recombination-mediated cassette exchange (RMCE) technology also is attracting interest for targeted gene insertion. That technology has increased success rates and reduced timelines for the generation of stable industrial-grade CHO cell lines expressing MAbs reliably.

Second-Generation Genome-Editing Tools: This group includes endonucleases such as zinc finger nucleases (ZFN), meganucleases, transcription activator-like effectors nucleases (TALEN), and CRISPR-Cas9. Both ZFN and TALEN technologies rely on the ability to customize a DNA-binding domain for a specific sequence (the targeted sequence for cleavage) combined to a nuclease effector domain. CRISPR-Cas9 technology already has been validated for use with CHO cells and has been implemented to reduce production variability among clones. However, ZFN, TALEN and CRISPR-Cas9 technologies are used mostly for gene-specific knockout.
One critical challenge is to identify hotspots in a host genome that enable good expression levels and stability. Such specific integration might not be a one-size-fits-all approach because some therapeutic proteins could require a particular level of expression to fold correctly or to present adequate quality attributes (e.g., glycosylation and proteolytic processing). The discovery of additional naturally occurring RNA-guided nucleases offers increased targeting flexibility.

Some researchers also have engineered Cas9 enzymes to exhibit relaxed protospacer-adjacent motif (PAM) specificities. Such crucial advances expand the number of target loci that are amenable to RNA-guided genome editing. Other scientists have engineered Cas9 nuclease and managed to increase its DNA specificity dramatically. Thanks to the fusion of dead Cas9 (dCas9) to a cytidine deaminase enzyme that operates on ssDNA, “base editing” now can be used to generate point mutations in genomes.

Remarkably, CHO cells showed increased resistance to apoptosis after successful simultaneous (multiplex) disruption of fucosyltransferase 8 (FUT8), Bcl-2 associated X-protein (BAX), and Bcl-2 homologous antagonist killer (BAK) genes by CRISPR-Cas9 (1). The ZFN knockout approach achieved specific deletion of the glutamine synthetase (GS) and the dihydrofolate reductase (DHFR) genes in CHO cells, thus improving the selection stringency of the generated cell lines. Finally, both ZFN and a CRISPR-Cas9 approaches also were used for FUT8 gene-specific knockout. The resulting cell lines completely abolished fucosylation on the Fc domain of immunoglobulin G (IgG).

A less commonly used tool is mammalian artificial chromosome expression (ACE). This minigenome serves as an autonomous genetic element that replicates with cells. Its DNA sequence is customizable with different regulating elements that could help its expression.

The PiggyBac transposon system (System Biosciences) uses an efficient transposase purified from the cabbage looper moth (Trichoplusia ni) to integrate the gene of interest into a host genome. It has shown to improve yields for stable production of antibodies in CHO cell lines (2).

Genome-Editing Achievements: Introduction of additional N-glycan target sites into desired positions on the protein backbone by genetic mutation has been used to create glycoproteins with enhanced levels of glycosylation (overexpression of sialyltransferases and other glycosyltransferases, inhibition of sialidases) and sialylation. That has extended serum halflives and improved in vivo activity (3). (N-glycans also can be crucial for protein folding.) Thanks to a comprehensive ZFN knockout screen of glycosyltransferase genes and the identification of key genes that control decisive steps in N-glycosylation in CHO cells, it is now possible to provide homogeneous glycoforms.

Overexpression of B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) or B-cell lymphoma-extra large (Bcl-xL) has shown precise and efficient inhibition of apoptosis in recombinant CHO cell cultures by enhancing the culture’s longevity, cell viability, and endurance under environmental stresses. Consequently, that renders greater yields of therapeutic protein, which is a definite economic advantage in the biopharmaceutical industry. Similarly, down-regulation of caspases (e.g., caspase-8 and -9) and knockouts of proapoptotic genes (e.g., BAX and BAK) enhance the viability of both batch and fed-batch cultures. (Down-regulation of such genes can be achieved with various genome-editing techniques such as ZFNs, TALENs, and Cas systems).

One group that helped bridge those two technologies is the research team at the Memorial Sloan Kettering Institute Center for Cell Engineering. Directed by Michel Sadelain, the group has been an integral part of CAR-T therapy research, particularly targeting the CD19 molecule on white blood cells. CD19 is expressed on cells found in B-cell leukemia and resides on the cell surface, thereby making it available for antibody access. In 2017, Sadelain’s group published a study showing that directing a CD19-specific CAR to the T-cell receptor alpha constant (TRAC) locus increased T-cell potency. The modified cells “vastly outperformed conventionally generated CAR T-cells in mouse models of acute lymphoma leukemia,” with human trials planned (1).

CAR T-cells typically are made using retroviruses, but they insert CAR genes into random loci in genomes. CRISPR can be used to deliver CAR genes to specified targets in genomes. And current research is exploring the use of CRISPR–Cas9 editing to create next-generation CAR T-cell products, including “universal” CAR T-cells, making these cells more potent and controllable (2).

Les références
1 Eyquem J, et al. Targeting a CAR to the TRAC Locus with CRISPR/Cas9 Enhances Tumour Rejection. La nature 543(7643) 2017: 113–117 https://doi.org/10.1038/nature21405.

Therapeutic Protein Expression Regulation By Smart Promoters and Epigenomic Reprogramming
In the near future, research laboratories will be able to design transcriptional control systems and synthetic promoters, control the timing of gene expression at will by trigger-inducible transcription factors (TF), and protect against chromatin silencing. Researchers already have begun to edit the epigenome to alter regulation of a target gene. Moreover, effector fusions can be used to expand the repertoire of genome engineering modalities achievable using Cas9. And nonediting CRISPR tools are helping researchers to screen engineered cells for phenotypes of interest quickly and precisely.

CRISPR Intellectual Property Landscape and the Gene-Editing Innovation Roadmap
There is some risk that patent filings by academic institutions claiming critical components of the CRISPR-Cas9 technology could deter or slow down the development and use of the technology. However, research organizations and universities can establish a workable balance between access and control for essential research tools through sound management of intellectual property (IP). (For example, when the Cohen–Boyer patents were granted, Stanford University created a pioneering licensing program that provided a predictable legal framework for using its inventions. Nonexclusive licenses were made available to both companies and academic institutions. In fact, patent protection has played a significant role in the development of the technology to produce recombinant DNA in bacteria).

It has been widely publicized that several organizations have been filing patents over fundamental parts of the CRISPR-Cas9 system. Commercial assignees Dow AgroSciences and DuPont Nutrition Science together hold 33 inventions, all of which are related to crop and animal agriculture (genome-editing crop and weeds) and food (dairy industry) applications of the technology. In addition, the French company Cellectis holds rights on a broad patent for gene editing of cells in vitro. Academic institutions, through their licensing and spinoffs, are primarily in control of medical applications of CRISPR-Cas (e.g., The Broad Institute of Harvard University and the Massachusetts Institute of Technology (MIT) to Editas) with commercial partners (University of California at Berkeley to Caribou Biosciences and sublicensed to Intellia and Novartis).

It’s interesting that most patent holders appear to be pursuing a strategy of keeping an international option open for their portfolios. Fortunately, signs indicate that the pace of discovery and development of CRISPR is likely to continue, with a high probability of further improvements. The Broad Institute and MIT are building a portfolio on those principles and diversifying it.

Other gene-editing technologies might emerge to compete with or possibly even displace CRISPR-Cas (see “Alternative Gene-Editing Methods” box). Follow-on breakthroughs are likely to take center stage. Current patent holders will have difficulty pursuing restricted access to CRISPR-Cas9 for research use because it already is widely used in academic laboratories. The Broad Institute, MIT, and UC Berkeley already offer free use of the technologies they control for academic research purposes through Addgene, a nonprofit organization. Addgene uses the general terms of the Uniform Biological Material Transfer Agreement (UBMTA), which indicates that discoveries are owned by the recipient of the biological material and can be licensed for commercial use.

Inevitably, some of those new commercial applications could fall within the broadly drafted claims of the original patent and therefore require a second, commercial license. Inventors of follow-on applications using a CRISPR-Cas technology are likely to need a commercial sublicense from the respective exclusive commercial licensee that controls that technology (e.g., Editas, Caribou, Intellia, CRISPR Therapeutics, and Cellectis/Calyxt) rather than from the originating university.

One group that helped bridge those two technologies is the research team at the Memorial Sloan Kettering Institute Center for Cell Engineering. Directed by Michel Sadelain, the group has been an integral part of CAR-T therapy research, particularly targeting the CD19 molecule on white blood cells. CD19 is expressed on cells found in B-cell leukemia and resides on the cell surface, thereby making it available for antibody access. In 2017, Sadelain’s group published a study showing that directing a CD19-specific CAR to the T-cell receptor alpha constant (TRAC) locus increased T-cell potency. The modified cells “vastly outperformed conventionally generated CAR T-cells in mouse models of acute lymphoma leukemia,” with human trials planned (1).

CAR T-cells typically are made using retroviruses, but they insert CAR genes into random loci in genomes. CRISPR can be used to deliver CAR genes to specified targets in genomes. And current research is exploring the use of CRISPR–Cas9 editing to create next-generation CAR T-cell products, including “universal” CAR T-cells, making these cells more potent and controllable (2).

Epigenetic Control of Therapeutic Proteins
Conferring an open chromatin state in targeted chromosome loci (DNA stretches composed of nucleosome-depleted regions) can benefit transgene expression. Indeed, cis-acting epigenetic regulatory elements can help to remodel the chromatin environment, maintaining an active transcriptional state around a transgene. One type of epigenetic regulatory element (ERE) is the scaffold/matrix attachment region (S/MAR), thanks to which recombinant proteins could improve their expression levels significantly. Another class of EREs is chromatin opening elements (UCOEs), which confer an unmethylated, open chromatin state for transgene expression. UCOEs also have helped to increase the productivity of cell line producers of recombinant proteins.

Nonetheless, S/MAR and UCOE decrease the variability of expression between the different clones. Some epigenetic elements not only can help to increase the expression level of biotherapeutics, but also can increase the number of clones that have integrated a transgene with a more defined copy number of transgenes per cell, thus accelerating the selection process.

Protein Folding and Secretion of Recombinant Cells
Secretory bottlenecks of CHO cells can be relieved by overexpressing soluble N-ethylmaleimide–sensitive factor attachment protein receptors (SNAREs). New targets for cell-engineering approaches also can be identified based on metabolomics profiling. A bottleneck at the malate dehydrogenase II (MDHII) level was characterized for the tricarboxylic acid (TCA) cycle in CHO cells, and pyruvate metabolism was shown to vary between high-producing and low-producing anti-CD20 CHO clones (2). Over the years, many cell engineering strategies have been used in attempts to increase such titers by optimizing selection markers, gene expression, cell growth, proliferation, protein folding, and secretion. Among those engineering tools, CRISPR-Cas9 and RMCE technologies will contribute significantly to the advance of glycoprotein production shortly.

With remarkable advances in genome editing, technologies such as the CRISPR-Cas9 tool as well as the combination of next-generation sequencing with systems biotechnology exhibit extraordinary potential for discovery and modulation of novel cell engineering targets. Such efforts might finally pave the way for development of rationally designed host cells. Efforts now are ongoing to engineer PTMs in microbial, insect, and plant cell systems to make those systems more suitable for therapeutic protein production.

Les références
1 Baek E, Noh SM, Lee GM. Antiapoptosis Engineering for Improved Protein Production from CHO Cells. Heterologous Protein Production in CHO Cells. Humana Press: New York, NY, 2017: 71–85.

2 Lalonde ME, Durocher Y. Therapeutic Glycoprotein Production in Mammalian Cells. J. Biotechnol. 251, 2017: 128–140 https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.04.028.

3 Wang Q, et al. Glycoengineering of CHO Cells to Improve Product Quality. Heterologous Protein Production in CHO Cells. Humana Press: New York, NY, 2017, 25–44.


The future of CRISPR/Cas9

The rapid progress in developing Cas9 into a set of tools for cell and molecular biology research has been remarkable, likely due to the simplicity, high efficiency and versatility of the system. Of the designer nuclease systems currently available for precision genome engineering, the CRISPR/Cas system is by far the most user friendly. It is now also clear that Cas9&rsquos potential reaches beyond DNA cleavage, and its usefulness for genome locus-specific recruitment of proteins will likely only be limited by our imagination.


Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system

Animals carrying exogenous genes integrated at specific genomic loci are versatile tools for biological research 1 . Zebrafish (Danio rerio), an emerging vertebrate animal model, is widely used in studies on genetics, developmental biology and neurobiology. Although loss-of-function genomic editing for zebrafish has been well developed 2,3,4 , lack of feasible methods for inserting a large exogenous DNA sequence into the zebrafish genome is becoming a bottleneck for zebrafish-relevant research. It was reported that the coding sequence of enhanced green fluorescent protein (EGFP) can be integrated at the zebrafish tyrosine hydroxylase (e) locus through TALEN-mediated double-stranded breaks and homologous recombination (HR) with a low efficiency 6 . However, the targeted gene was destroyed and EGFP failed to express 6 . Recently, by using the type II bacterial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system (CRISPR/Cas9), two non-HR-based knockin approaches were developed to insert Gal4 (a transcriptional transactivator) and EGFP into zebrafish genomic loci with a relatively high efficiency 7,8 . However, the coding sequence of targeted endogenous genes was disrupted or the expression pattern of inserted exogenous genes could not well recapitulate the endogenous ones as insertion occurred within either the exon 7 or cis-regulatory elements of targeted genes 8 . These disadvantages will limit their application in neuroscience research. Here, using the CRISPR/Cas9 system, we developed an intron targeting-mediated and HR-independent efficient knockin approach for zebrafish, with which the intactness of the coding sequence and regulatory elements of targeted endogenous genes are maintained.

The Th protein is a rate-limiting enzyme for synthesizing two important neuromodulators, dopamine and noradrenline. As dopamine and noradrenline are synthesized and released by dopaminergic and noradrenergic neurons, respectively, Th is a specific marker for these cells. We designed a short guide RNA (sgRNA) targeting the last intron of the zebrafish e and performed co-injection of sgRNA and mRNA of zebrafish codon-optimized Cas9 (zCas9) into one-cell-stage zebrafish embryo, which yielded a cleavage efficiency of ∼ 83% (Supplementary information, Table S1A and S1B). Next, we designed a donor plasmid th-P2A-EGFP consisting of three parts: a left arm, a P2A-EGFP coding sequence, and a right arm (Figure 1A). To retain the full coding sequence of e, the left arm begins from the upstream of the 5′ side of the sgRNA target site in the last intron, spans the whole last exon E13, and ends at the last base just before the stop codon of e. To keep the normal control of Th expression, the right arm includes the stop codon and 3′ regulatory elements of e. The P2A peptide is a linker for multicistronic expression 9 .

Intron targeting-mediated EGFP knockin at the zebrafish e lieu. (UNE) Schematic of the intron targeting-mediated strategy for generating EGFP knockin at the zebrafish e locus by using the CRISPR/Cas9 system. The sgRNA target sequence is shown in red and the protospacer adjacent motif (PAM) sequence in green. The left and right arm sequences of the donor plasmid are indicated by the brown lines with double arrows. The left arm is 1 298 bp, and the right arm is 671 bp. Les th-P2A-EGFP cassette was integrated into the e locus after co-injection of the donor with the sgRNA and zCas9 mRNA. The zebrafish e has 13 exons, and E12 and E13 represent the 12th and 13th exons, respectively. Right: the schematic of the mRNA and protein of the targeted e gène. (B) Representative projected in vivo confocal images (dorsal view) of th-P2A-EGFP knockin F1 larvae at 3 dpf, showing specific EGFP expression in various dopaminergic (OB, Pre, PT, and HI) and noradrenergic neurons (LC and MO). The white arrowheads mark non-specific signaling on the skin. A, anterior D, dorsal R, right. Scale bar, 50 μm. (C) PCR analysis of the 5′ and 3′ junctions of F1 progenies from the 7# founder. The F1, R1, F2 and R2 primers are shown in UNE. (RÉ) 5′ and 3′ junction sequences of F1 progenies of three th-P2A-EGFP knockin F0 founders. The indel mutations are highlighted in yellow, and the PAM and sgRNA target sequences are shown in green and red, respectively. (E) Whole-mount in situ double immunostaining of th-P2A-EGFP knockin F1 larvae, showing that EGFP signaling (green) co-localizes with Th signals (red). The white arrowheads mark non-specific signaling on the skin. Scale bar, 20 μm. (F) Western blot of the Th expression in WT and heterozygous th-P2A-EGFP knockin F1 embryos. (g) Dopamine (DA) immunostaining of th-P2A-EGFP knockin F1 (top) and WT larvae (bottom left). Bottom right: DA intensity of DA-positive neurons in WT and knockin F1 larvae. The numbers on the bars represent the numbers of cells examined. Scale bar, 10 μm. (H) Bright-field image showing in vivo whole-cell recording of EGFP-expressing LC neurons in a homozygous th-P2A-EGFP knockin F2 larvae. The black arrow indicates the recording microelectrode. Scale bar, 10 μm. (JE) Whole-cell currents of an EGFP-expressing LC neuron. Under voltage-clamp mode, the neuron was held at −60 mV and voltage pulses from −100 to 30 mV with an interval of 10 mV were applied. Action potential currents (arrow) appear near −30 mV.

We co-injected the donor plasmid, sgRNA and the zCas9 mRNA into one-cell-stage fertilized zebrafish egg. As both the donor plasmid DNA and the last intron of e contain sgRNA target site, concurrent cleavage by sgRNA/Cas9 would result in efficient and specific integration of the donor DNA into the e locus via non-HR. Indeed, we observed EGFP expression in the brain of injected larvae 3 days post fertilization (dpf) (33/139 Supplementary information, Figure S1A1 and Table S1B). Based on their location and morphology 10 , EGFP-expressing cells included dopaminergic neurons in the posterior tubercular (PT), intermediate hypothalamus (HI) and pretectum (Pre), and noradrenergic neurons in the locus coeruleus (LC) and medulla oblongata (MO) (Supplementary information, Figure S1A1). Successful non-HR-mediated insertion of the th-P2A-EGFP donor was then verified by PCR using target site- and donor-specific primers and junction sequencing analysis (Supplementary information, Figures S1A2 and S1A3). The specificity of knockin events was further confirmed by in situ immunohistochemistry staining, which revealed that EGFP was co-localized with Th in 46 out of 48 Th-positive cells in three larvae examined (Supplementary information, Figures S1A4 and S1A5).

To examine the germline transmission of knockin events, 25 embryos showing mosaic expression of EGFP were raised to adulthood. Each of them was then outcrossed to wild-type (WT) zebrafish, and their F1 progenies were screened for EGFP signal. Three F0 founders were identified, and EGFP-positive F1 progenies were produced at rates ranging from 15.5% to 21.1% (Supplementary information, Table S1C). As expected, in comparison with F0 (Supplementary information, Figure S1A1), more EGFP-expressing dopaminergic and noradrenergic neurons were observed in F1 progenies (Figure 1B), including neurons in the olfactory bulb (OB), Pre, PT, HI, LC and MO. PCR and junction sequencing analysis of F1 progenies confirmed the inheritance of the genomic integration of their corresponding F0 founders (Figure 1C and 1D). Immunostaining was also performed in the F1 embryos of th-P2A-EGFP knockin fish, and EGFP signal was found to be well co-localized with the Th protein (98% ± 1%, mean ± SEM, in 5 larvae Figure 1E), suggesting the high specificity of EGFP expression in the stable knockin lines.

As the full reading frame and regulatory elements of e were maintained by using this knockin strategy, both the integrity and expression pattern of the gene product should be normal. To examine these points, we extracted the total protein from F1 embryos carrying EGFP knockin at e and performed western blot analysis. F1 embryos were heterozygous because they were generated by crossing knockin F0 founders with WT fish. By using a Th antibody, two bands for knockin embryos were detected (Figure 1F). The lower band at around 56 kDa represents the WT Th protein derived from a WT e allèle. The P2A peptide is about 2 kDa and cleaved between the last two amino acids. If knockin events did not affect the integrity of the Th protein, the cleavage of the Th-P2A-EGFP protein will result in two products: Th-P2A fusion protein (58 kDa) and EGFP protein (Figure 1A). Therefore, the upper band at around 58 kDa indicates the integrity of the Th protein produced from a knockin e allèle. Furthermore, the expression levels of the WT Th protein and the knockin Th-P2A fusion protein were almost equal (Figure 1F), further suggesting that our knockin strategy does not impair the expression level of the targeted endogenous gene. To examine whether knockin events affect Th functions, we then performed immunostaining of dopamine, the level of which can reflect the activity of Th. The intensities of dopamine signals in dopaminergic neurons were not significantly different between knockin F1 and WT embryos (P = 0.4 Figure 1G), suggesting that Th function is not affected by knockin events.

To examine the physiological normality of neurons carrying targeted integration, in vivo whole-cell recording was subsequently performed in homozygous th-P2A-EGFP knockin F2 larvae (Figure 1H). EGFP-expressing neurons exhibited a normal intrinsic membrane property, as reflected by outwardly rectifying whole-cell currents (Figure 1I).

To extend the application of our knockin strategy to other exogenous genes, we generated knockin fish carrying the transactivator protein Gal4 au e locus by using the same strategy, in which only the EGFP coding sequence was replaced with the Gal4 sequence (th-P2A-Gal4 Supplementary information, Figure S1B1). After injection of Gal4 knockin-relevant elements into fertilized eggs of Tg(UAS:GCaMP5) transgenic zebrafish, integration events were visualized by the expression of GCaMP5 in dopaminergic or noradrenergic neurons (Supplementary information, Figure S1B2). As GCaMP5 is a genetically encoded calcium indicator, we could observe mechanical stimulus-induced calcium responses in neurons by puffing water to the fish tail through a micropipette. We also injected the Gal4 knockin-relevant elements into WT fish to screen for th-P2A-Gal4 knockin founders. As the Gal4 protein has no fluorescence, we raised the injected knockin embryos to adulthood without prior selection and crossed these adults with Tg(UAS:Kaede) transgenic fish. Two founders were identified among the total of 28 injected fish (Supplementary information, Table S1D), as evidenced by the fact that dopaminergic neurons were labeled by Kaede in their progenies, which were produced at a mean rate of ∼ 7% (Supplementary information, Figure S1B4 and Table S1D). Successful insertion of the th-P2A-Gal4 donor was then verified by PCR and junction sequencing analysis in F1 progenies (Supplementary information, Figures S1B5 and S1B6).

It was reported that the CRISPR/Cas9 system shows a high frequency of off-target (OT) cleavage in human cell lines, and the specificity of Cas9 targeting can tolerate up to three base pair (bp) mismatches between a sgRNA and its target DNA 11 . We therefore searched all zebrafish genomic loci containing up to 3-bp mismatches in comparison with the coding sequence of the e sgRNA, and found three potential OT sites. PCR and sequencing analysis of those potential OT sites in the genome of injected WT embryos or th-P2A-EGFP knockin F1 embryos did not reveal indels (Supplementary information, Table S1E), suggesting a low OT rate associated with our knockin strategy.

The applicability of our knockin strategy was further validated by targeting other endogenous genes specifically expressed in different types of cells, as exemplified by the integration of EGFP into the zebrafish tryptophan hydroxylase 2 (tph2), glial fibrillary acidic protein (gfap), and flk1 loci. Ces EGFP insertions resulted in the specific labeling of serotoninergic neurons, glia and vascular endothelial cells, respectively (Supplementary information, Figures S1C-S1E, and Table S1A and S1B). It is worth noticing that, in the case of the tph2 knockin, the second last intron was selected for targeting, indicating that the last intron is the first but not the only choice for targeting. Furthermore, by replacing the P2A dans le gfap-P2A-EGFP plasmid with a flexible serine-serine linker sequence, we succeeded in fusing an EGFP tag to endogenous Gfap (Supplementary information, Figure S1F), demonstrating that our knockin strategy can also be used to tag endogenous proteins.

Taking advantage of both the HR for donor design and the non-HR for donor integration, we developed a novel CRISPR/Cas9-mediated intron-targeting knockin strategy, by which knockin zebrafish can be efficiently generated without disruption of targeted endogenous genes. Compared with HR, error-prone non-homologous end joining (NHEJ)-involved non-HR knockin for zebrafish has two advantages. First, NHEJ is at least 10-fold more active than HR during early zebrafish development 12 . Second, unlike HR, NHEJ does not need the precise homology between the parent zebrafish and the targeting donor, avoiding time-consuming screening and genotyping of parent animals. More importantly, to maintain the integrity of targeted endogenous genes, we designed sgRNAs targeting introns, so that NHEJ-mediated indel mutations do not change the reading frame of targeted genes. In addition, intron targeting also theoretically increases the rate of in-frame insertion up to 3-fold in comparison with exon-based targeting. Furthermore, we artificially added the endogenous genome sequence spanning from the sgRNA target site to the 3′ intergenic region into donor plasmids. Therefore, the predicted forward ligation of the donor into the targeted locus retains the original reading frame and both 5′ and 3′ regulatory elements of targeted genes. Taken together, this strategy has two advantages: (1) inserted exogenous genes can faithfully recapitulate the expression pattern of targeted endogenous genes (2) the expression and function of targeted endogenous genes are maintained. Thus, the readiness, high efficiency and targeted gene integrity maintenance make our strategy an applicable knockin approach for zebrafish and even other organisms.


1. Introduction

For many years, molecular biologists have sought ways to use cellular repair mechanisms to manipulate DNA through genome editing. In this way, they would have the power to change the genome by correcting a mutation or introducing a new function (Rodriguez, 2016). For this purpose, genome editing technologies were developed (Memi et al., 2018). In recent years, clustered regularly interspaced short palindromic repeats technology (CRISPR-Cas9) has become the most preferred method of gene editing. This technology has advantages such as high accuracy, easy handling, and relatively low cost compared to previous technologies, such as zinc-finger nuclease (ZFN) and transcription activator-like effector nuclease (TALEN). Thanks to these benefits, CRISPR-Cas9 technology can be easily applied in any molecular biology laboratory.

Genome editing technologies are used in the formation of human disease models in experimental animals and for the understanding of basic gene functions. They also have great therapeutic potential for future treatment of untreated diseases such as certain cancers, genetic disorders, and HIV/AIDS. Today, genome editing in somatic cells is one of the promising areas of therapeutic development (Otieno, 2015). However, various bioethical issues have arisen due to the potential impact of these technologies on the safety of food stocks and clinical applications (Hundleby and Harwood, 2018 Hirch et al., 2019). This review discusses the challenges, possible consequences, and bioethical issues of CRISPR-Cas9 in detail.


Chickens and pigs with integrated genetic scissors

Researchers at the TUM have demonstrated a way to efficiently study molecular mechanisms of disease resistance or biomedical issues in farm animals. Researchers are now able to introduce specific gene mutations into a desired organ or even correct existing genes without creating new animal models for each target gene. This reduces the number of animals required for research..

CRISPR/Cas9 enables desired gene manipulations

CRISPR/Cas9 is a tool to rewrite DNA information. Genes can be inactivated or specifically modified using this method. The CRISPR/Cas9 system consists of two components.

The gRNA (guide RNA) is a short sequence that binds specifically to the DNA segment of the gene that is to be modified. The Cas9 nuclease, the actual "gene scissors," binds to the gRNA and cuts the respective section of the target DNA. This cut activates repair mechanisms that can inactivate gene functions or incorporate specific mutations.

Healthy chickens and pigs with integrated gene scissors

"The generated animals provide the gene scissors, the Cas9 protein, right along with them. So all we have to do is to introduce the guide RNAs to get animals which have specific genetic characteristics," explains Benjamin Schusser, Professor of Reproductive Biotechnology at the TUM. "The initial generation of these animals took about three years. Cas9 can now be used at all stages of animal development, since every cell in the body permanently possesses the Cas9 protein. We have been successfully able to utilize this technique in chicken embryos as well as in living pigs."

The healthy chickens and pigs produced by the researchers thus possess the Cas9 nuclease in all organs studied. This is particularly useful in biomedical and agricultural research.

Analytical tool to fight viral or cancer diseases

Pigs are used as disease models for humans because their anatomy and physiology are much more similar to humans in comparison to mice (currently a common disease model). Thus, a modified pig may help to better understand the mechanism of carcinogenesis in humans. Potential new treatments for humans can also be tested in animal models.

"Due to the presence of Cas9 in the cells the processes are significantly accelerated and simplified," says Angelika Schnieke, Professor of Livestock Biotechnology at the TUM. "Cas9-equipped animals make it possible, for example, to specifically inactivate tumor-relevant genes and to simulate cancer development."

Cas9 pigs and chickens enable researchers to test which genes might be involved in the formation of traits, such as disease resistance, directly in the animal. "The mechanism of the CRISPR/Cas9 system may also be useful for combating infections using DNA viruses. Initial cell culture experiments showed that this already works for the avian herpes virus," says Prof. Schusser.

Important resource for biomedical and agricultural research

Prof. Schnieke notes, "Our Cas9-expressing chickens and pigs represent an innovative resource for genome editing in the biomedical and agricultural sciences, but beyond that, these animals are also available to other research groups. Hence, efficient genome editing in living animals has the potential to significantly advance biomedical and agricultural research."


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