Informations

Deux brins d'ADN dénaturés peuvent-ils se réassocier ?

Deux brins d'ADN dénaturés peuvent-ils se réassocier ?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Qu'importe si j'augmente la température à 95°C. Donc ADN double brin dénaturé en deux ADNsb, puis je baisse la température à température ambiante. Sont-ils capables de se réassocier après dénaturation ?


Oui, chauffer l'ADN au-dessus de 94 °C pendant un certain temps fera fondre ou dénaturera l'ADNdb en deux brins d'ADNsb. Lors du refroidissement, les brins complémentaires reviendront se recuire. Le degré et l'exhaustivité de l'hybridation, ou de l'association, dépendent d'un certain nombre de facteurs, notamment la vitesse de refroidissement et les propriétés structurelles de l'ADN lui-même (% de teneur en GC, structure secondaire). Je ne m'attendrais pas à ce que la majorité des brins d'ADNsb s'hybride complètement à un seul brin d'ADNdb complémentaire. Ce qui est plus probable, c'est que le mélange d'ADN ressemblera davantage à des spaghettis avec un brin partiellement recuit à deux autres brins. Lors de l'exécution de la PCR, les amorces sont conçues pour être spécifiques et ajoutées en excès, de sorte que vous biaisez les chances d'hybridation pour favoriser une association amorce:ADNsb. Si ce n'était pas le cas, nous ne pourrions pas avoir une amplification PCR efficace.


Deux brins d'ADN dénaturés peuvent-ils se réassocier ? - La biologie

Technologie d'hybridation

Acides nucléiques renaturants

En revanche, le recuit de deux brins simples est un bi-moléculaire réaction.

Deux brins simples complémentaires
doivent se rencontrer
puis des paires de bases complémentaires se forment entre les deux brins.

Comme il s'agit d'une réaction bimoléculaire, la vitesse de la réaction dépend de la concentration des réactifs - les deux brins complémentaires.

Étant donné que le recuit est une réaction bimoléculaire, nous nous intéressons principalement à la vitesse à laquelle la réaction se produit.

Les conditions de réaction de réannelage sont donc choisies pour MAXIMISER la vitesse à laquelle les hybrides se forment.

La courbe de droite montre comment la vitesse de recuit dépend de la température.

Pour maximiser le taux de réannelage, nous hybridons généralement 15 °C en dessous de la Tm de l'hybride. L'hybridation se fait également à haute teneur en sel pour minimiser la répulsion de la
squelettes sucre-phosphate.

Afin de visualiser ce concept, considérons le réhybridation d'une variété d'échantillons d'ADN.

Pour standardiser les conditions,
chaque échantillon d'ADN est cisaillé en fragments aléatoires de 500 pb de long.
Chaque échantillon d'ADN est à la même concentration d'ADN (50 ug/ml) et de NaCl (1M).
Chaque échantillon est chauffé à ébullition pour le dénaturer puis maintenu à (Tm-15 o C) tandis que la quantité d'ADN restant simple brin est surveillée.

Le % simple brin est représenté graphiquement en fonction de

Cot - la concentration initiale d'ADN (Co) fois le temps (t)

Comme la réaction suit une cinétique bimoléculaire, on peut obtenir une valeur

Lit bébé1/2 = Cot auquel 1/2 de l'ADN s'est réannelé

Lit bébé1/2 mesure le taux de réannelage qui est inversement proportionnel à la concentration des séquences complémentaires examinées.

Petit lit bébé1/2 les valeurs indiquent que les séquences complémentaires sont à forte concentration.
(ils se recuit très vite, c'est petit)
Grand lit bébé1/2 les valeurs indiquent que les séquences complémentaires sont à faible concentration.
(ils se recuit très lentement, il est gros)

Les exemples suivants sont ment pour illustrer l'analyse "Cot (bonne chance)

Le milieu de la courbe fournit la valeur de Cot1/2 - le temps nécessaire pour que la moitié des simples brins soit sous forme double brin à une concentration d'ADN initiale définie.

Contrairement à l'exemple ci-dessus, le génome d'E. coli se compose de 5 000 000 pb de séquence unique.

Encore une fois, en traçant le % simple brin en fonction de Cot, nous observons une seule courbe sigmoïde confirmant que le génome d'E coli se rehybride en une seule classe cinétique.

Notez que la courbe Cot s'est déplacée vers la droite par rapport à la courbe lambda Cot. L'augmentation du lit bébé1/2 reflète le nombre de copies du génome d'E coli en solution par rapport au génome lambda. Étant donné que le génome d'E coli est 2 ordres de grandeur plus grand que le génome lambda, tout fragment de 500 pb sera présent à une concentration 100 fois plus faible dans l'échantillon du génome d'E coli.

Cela peut être illustré en considérant ce qui se passe lorsque l'échantillon d'ADN se compose de quantités égales de masse des génomes lambda et E coli (chacun à 25 ug/ml)

La courbe de Cot a maintenant deux composantes cinétiques,
chacun comprenant environ la moitié de l'ADN total dans l'échantillon,
un avec un lit bébé1/2 du génome lambda,
un avec un lit bébé1/2 du génome d'E coli.

Et les eucaryotes ? A quoi ressemble le reannelage des génomes eucaryotes ?

Contrairement à la plupart des procaryotes, les courbes de Cot des génomes eucaryotes sont des courbes complexes. La modélisation basée sur la cinétique bimoléculaire nous permet d'« ajuster » les données pour définir trois classes cinétiques qui diffèrent par leur fréquence de répétition dans le génome.

La première classe représente une petite partie du génome (typiquement 10% environ) mais est très fortement répétée (10 000 copies). Ce sont de courtes séquences répétées très regroupées trouvées au niveau des télomères et des centromères eucaryotes. Des copies dispersées de ces répétitions de séquences simples sont également courantes.

La troisième classe cinétique est la séquence unique du génome. Dans cette classe, on retrouve la plupart des séquences codant pour les protéines du génome. Cette classe contient généralement la majorité de la séquence dans le génome eucaryote.


Exemples de protéines dénaturées

Bien que la dénaturation des protéines soit préjudiciable à la survie des cellules, elle est souvent rencontrée dans la vie quotidienne. Par exemple, le blanc d'œuf est principalement composé de protéines solubles et est liquide et translucide dans les œufs frais. Lorsqu'elle est bouillie, la chaleur dénature les protéines et leur fait perdre de la solubilité. Les protéines dénaturées s'agrègent et forment une masse désormais opaque et solide. De même, modifier le pH du lait en ajoutant des acides tels que l'acide citrique du jus de citron dénature les protéines du lait et fait cailler le lait. La partie blanche solide qui se sépare du lactosérum est une protéine dénaturée. Cela peut également être observé lorsque le lait caille naturellement en raison de la colonisation bactérienne. Les bactéries peuvent produire de l'acide lactique comme sous-produit du métabolisme. Lorsqu'il est correctement contrôlé, ce processus de dénaturation est utilisé pour fabriquer du yaourt et du fromage frais.


Classes cinétiques de discussion adn-biologique

Dans cet article, nous discuterons de la séquence répétée de l'ADN chromosomique.

Les génomes eucaryotes contiennent une grande quantité de séquences répétitives, parfois présentes en centaines ou en milliers de copies par génome. La compréhension des séquences répétitives repose sur des études menées sur la dénaturation (séparation de la double hélice d'ADN en ses deux brins composants) et la renaturation (réassociation des simples brins en molécules d'ADN double brin stables) de l'ADN.

Les deux brins d'une molécule d'ADN sont maintenus ensemble par de faibles liaisons non covalentes. Lorsque l'ADN est réchauffé dans une solution saline, une température est atteinte lorsque deux brins commencent à se séparer, conduisant à des molécules simple brin en solution. C'est ce qu'on appelle la dénaturation thermique ou la fusion de l'ADN.

La progression de la dénaturation thermique peut être suivie en observant l'augmentation de l'absorbance de l'ADN dissous. Les bases azotées de l'ADN absorbent le rayonnement ultraviolet avec un maximum d'absorbance proche de 260 nm. Dans l'ADN simple brin, les interactions hydrophobes provoquées par l'empilement des bases sont augmentées, ce qui augmente la capacité des bases à absorber le rayonnement ultraviolet.

La température à laquelle le changement d'absorbance est à moitié terminé est appelée température de fusion (Tm) de l'ADN. Plus la teneur en GC de l'ADN est élevée, plus la Tm est élevée. La raison en est qu'il existe 3 liaisons hydrogène entre G et C qui confèrent une stabilité aux paires GC, par rapport aux paires AT qui sont reliées par deux liaisons hydrogène. Ainsi, les sections d'ADN riches en AT fondent avant les riches en GC.

Lorsque l'ADN dénaturé est refroidi lentement, les brins simples se réassocient pour former des molécules double brin et les propriétés de l'ADN double hélice sont restaurées, c'est-à-dire qu'il absorbe moins de lumière ultraviolette. C'est ce qu'on appelle la renaturation ou le recuit. Comme décrit plus loin, la propriété de réannelage a conduit au développement d'une méthodologie appelée hybridation d'acide nucléique.

Britten et Kohne (1967) ont étudié la cinétique de renaturation de l'ADN et découvert des séquences répétées.

Walker (1969) distingue 3 classes cinétiques d'ADN :

Fraction de réannelage rapide ou ADN très répétitif,

Fraction de réannelage intermédiaire ou ADN modérément répétitif, et

La fraction unique ou copie unique à recuit lent.

1. Séquences d'ADN hautement répétées :

Aussi appelé ADN réitéré ou redondant. Constitué de séquences présentes dans au moins un million de copies par génome, constitue environ 10 % de l'ADN total chez les vertébrés. De telles séquences sont généralement courtes, longues d'environ quelques centaines de nucléotides, et présentes en grappes dans lesquelles la séquence donnée est répétée encore et encore sans interruption dans des réseaux en tandem (de bout en bout). Les séquences hautement répétées comprennent les ADN satellites, les ADN minisatellites et les ADN microsatellites.

Se compose de courtes séquences d'environ 5 à 100 pb. Au cours de la centrifugation en gradient de densité, l'ADN satellite se sépare en une bande distincte, car la composition en bases de l'ADN satellite est différente de celle de l'ADN en vrac. Une espèce peut avoir plus d'une séquence satellite comme chez Drosophila virilis qui a 3 séquences satellites de 7 nucléotides chacune.

L'ADN satellite est présent autour des centromères dans l'hétérochromatine centromérique. Chez l'homme, 3 blocs d'ADN satellite sont présents dans les constrictions secondaires des chromosomes 1, 9 et 16. Un quatrième bloc est présent à la partie distale du bras long du chromosome Y.

Ceux-ci se produisent généralement en grappes avec environ 3000 répétitions, leur taille allant de 12 à 100 pb de longueur. Les séquences minisatellites occupent des portions plus courtes du génome que les séquences satellites. Les minisatellites sont souvent instables et le nombre de copies de minisatellites peut augmenter ou diminuer d'une génération à l'autre. La longueur du locus du minisatellite pourrait varier au sein d'une même famille et dans la population (polymorphisme). Les changements dans les séquences des minisatellites peuvent affecter l'expression des gènes voisins.


Matériaux et méthodes

Traitements plasmides/ADN et réactions de dénaturation/renaturation

Les clones génomiques du locus DM humain (positions 357-433, comme en 7) contenant le (CTG)m·(CAG)m répéter, où m = 30, m = 50 et m = 255, ont été décrits ( 4, 5, 8). Les m = 30 et m = 50 tracts répétés sont exempts d'interruptions de séquence, tandis que le m = 255 tract contient quatre interruptions ACT résultant en un tract de (CTG)27ACT (CTG)40ACT (CTG)38ACT (CTG)40ACT (CTG)106±5. Les plasmides ont été préparés en utilisant une lyse détergente comme décrit précédemment (5). Les plasmides ont été traités avec les RNases A et T1 sans DNase (Sigma), extraits au phénol, purifiés deux fois par centrifugation isopycnique et conservés dans du TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6) à -20°C. Toutes les précautions ont été prises pour éviter les délétions lors de la propagation du plasmide dans Escherichia coli ( 5, 9).

Le marquage des extrémités 5' ou 3' a été réalisé en utilisant la polynucléotide kinase T4 (USB) ou la transcriptase inverse AMV (USB) respectivement comme décrit (4, 5, 10, 11). Toutes les réactions de dénaturation/renaturation ont été effectuées comme décrit et des mesures de précaution ont été prises pour éviter la déshydratation de l'échantillon (4, 5, 10, 11). Toutes les enzymes de restriction ont été achetées auprès de New England Biolabs et les réactions ont été effectuées comme spécifié par le fabricant. Les structures à brins glissés ont été excisées de gels de Polyacrylamide et l'ADN a été électroélué comme décrit (5, 10, 11).

Électrophorèse

Des gels de polyacrylamide (4 %, 13 × 9 × 0,15 cm, 40:2 acrylamide : bis-acrylamide) ont été coulés dans du TBE (90 mM Tris, 90 mM borate, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) et soumis à une tension constante (150 mM V, 10–12 V/cm) à température ambiante, sauf indication contraire. Les gels ont ensuite été colorés au bromure d'éthidium, photographiés et/ou séchés sur papier Whatman et exposés à un film radiographique (Kodak) en présence d'un écran renforçateur à -70°C ou d'un écran PhosphorImager (Molecular Dynamics). La quantité d'ADN-S formé a été mesurée par des analyses densitométriques en pourcentage de la population totale de molécules contenant des répétitions. Toutes les quantifications ont été effectuées sur 3 à 10 expériences par analyse PhosphorImager à l'aide du logiciel ImageQuant (Molecular Dynamics). Toutes les migrations relatives et les estimations de paires de bases ont été calculées par rapport à la migration d'une échelle de 123 pb (Gibco BRL) comme décrit précédemment (8).

Microscopie électronique

Des échantillons d'ADN ont été préparés et l'EM a été réalisée comme décrit (12). En bref, les échantillons ont été mélangés avec un tampon contenant 0,15 M de NaCl, 1 mM de MgCl2 et 2 mM de spermidine, adsorbée sur de minces films de carbone chargés luminescents, lavée avec une série eau/éthanol gradué et ombre portée rotative avec du tungstène. Les échantillons ont été examinés à l'aide d'un microscope électronique Phillips CM12. Les micrographies sont présentées en contraste inversé. Un scanner de film multiformat Nikon connecté à un ordinateur Macintosh et Adobe Photoshop a été utilisé pour former des montages des images.

Dénaturer et renaturer des fragments d'ADN DM contenant (CTG)m·(CAG)m les répétitions entraînent une migration lente des ADN par rapport aux ADN qui n'ont jamais été dénaturés/renaturés. (UNE) Carte du DM (CTG)m·(CAG)mHindIII-ÉcoFragment RI. Les séquences flanquantes humaines non répétitives (positions 357 à 375 et 391 à 433, comme en 7) sont en gras. Les lignes fines représentent des séquences de vecteurs plasmidiques. (B) (CTG)m·(CAG)m-contenant des fragments avec m = 30 et m = 50 sont affichés. Témoins linéaires non traités (LNT) (pistes 1 et 3) et réanalés (RD) (pistes 2 et 4) marqués au 32P HindIII-ÉcoLes produits de digestion par restriction RI ont été séparés sur un gel de polyacrylamide à 4 %, séchés et exposés pour une autoradiographie. Les parenthèses indiquent la distribution de la radioactivité totale migrant de façon anormale après le recuit. Les ADN duplex linéaires sont également indiqués. Le schéma des produits à migration lente était impossible à distinguer lorsque les brins CTG ou CAG étaient radiomarqués, indiquant que les nouveaux produits étaient composés à la fois de brins contenant CTG et CAG. (C) Propension à la formation d'ADN-S en fonction de la longueur de répétition. Les pourcentages ont été mesurés comme décrit dans Matériels et méthodes.

Dénaturer et renaturer des fragments d'ADN DM contenant (CTG)m·(CAG)m les répétitions entraînent une migration lente des ADN par rapport aux ADN qui n'ont jamais été dénaturés/renaturés. (UNE) Carte du DM (CTG)m·(CAG)mHindIII-ÉcoFragment RI. Les séquences flanquantes humaines non répétitives (positions 357 à 375 et 391 à 433, comme en 7) sont en gras. Les lignes fines représentent des séquences de vecteurs plasmidiques. (B) (CTG)m·(CAG)m-contenant des fragments avec m = 30 et m = 50 sont affichés. Témoins linéaires non traités (LNT) (pistes 1 et 3) et réanalés (RD) (pistes 2 et 4) marqués au 32P HindIII-ÉcoLes produits de digestion par restriction RI ont été séparés sur un gel de polyacrylamide à 4 %, séchés et exposés pour une autoradiographie. Les parenthèses indiquent la distribution de la radioactivité totale migrant de façon anormale après le recuit. Les ADN duplex linéaires sont également indiqués. Le schéma des produits à migration lente était impossible à distinguer lorsque les brins CTG ou CAG étaient radiomarqués, indiquant que les nouveaux produits étaient composés à la fois de brins contenant CTG et CAG. (C) Propension à la formation d'ADN-S en fonction de la longueur de répétition. Les pourcentages ont été mesurés comme décrit dans Matériels et méthodes.


Séquence répétée d'ADN chromosomique | La génétique

Dans cet article, nous discuterons de la séquence répétée de l'ADN chromosomique.

Les génomes eucaryotes contiennent une grande quantité de séquences répétitives, parfois présentes en centaines ou en milliers de copies par génome. La compréhension des séquences répétitives repose sur des études menées sur la dénaturation (séparation de la double hélice d'ADN en ses deux brins composants) et la renaturation (réassociation des simples brins en molécules d'ADN double brin stables) de l'ADN.

Les deux brins d'une molécule d'ADN sont maintenus ensemble par de faibles liaisons non covalentes. Lorsque l'ADN est réchauffé dans une solution saline, une température est atteinte lorsque deux brins commencent à se séparer, conduisant à des molécules simple brin en solution. C'est ce qu'on appelle la dénaturation thermique ou la fusion de l'ADN.

La progression de la dénaturation thermique peut être suivie en observant l'augmentation de l'absorbance de l'ADN dissous. Les bases azotées de l'ADN absorbent le rayonnement ultraviolet avec un maximum d'absorbance proche de 260 nm. Dans l'ADN simple brin, les interactions hydrophobes provoquées par l'empilement des bases sont augmentées, ce qui augmente la capacité des bases à absorber le rayonnement ultraviolet.

La température à laquelle le changement d'absorbance est à moitié terminé est appelée température de fusion (Tm) de l'ADN. Plus la teneur en GC de l'ADN est élevée, plus la Tm est élevée. La raison en est qu'il existe 3 liaisons hydrogène entre G et C qui confèrent une stabilité aux paires GC, par rapport aux paires AT qui sont reliées par deux liaisons hydrogène. Ainsi, les sections d'ADN riches en AT fondent avant les riches en GC.

Lorsque l'ADN dénaturé est refroidi lentement, les brins simples se réassocient pour former des molécules double brin et les propriétés de l'ADN double hélice sont restaurées, c'est-à-dire qu'il absorbe moins de lumière ultraviolette. C'est ce qu'on appelle la renaturation ou le recuit. Comme décrit plus loin, la propriété de réannelage a conduit au développement d'une méthodologie appelée hybridation d'acide nucléique.

Britten et Kohne (1967) ont étudié la cinétique de renaturation de l'ADN et découvert des séquences répétées.

Walker (1969) distingue 3 classes cinétiques d'ADN :

Fraction de réannelage rapide ou ADN hautement répétitif,

Fraction de réannelage intermédiaire ou ADN modérément répétitif, et

La fraction unique ou copie unique à recuit lent.

Classes cinétiques d'ADN :

1. Séquences d'ADN hautement répétées :

Aussi appelé ADN réitéré ou redondant. Constitué de séquences présentes dans au moins un million de copies par génome, constitue environ 10 % de l'ADN total chez les vertébrés. De telles séquences sont généralement courtes, longues d'environ quelques centaines de nucléotides, et présentes en grappes dans lesquelles la séquence donnée est répétée encore et encore sans interruption dans des réseaux en tandem (de bout en bout). Les séquences hautement répétées comprennent les ADN satellites, les ADN minisatellites et les ADN microsatellites.

Se compose de courtes séquences d'environ 5 à 100 pb. Au cours de la centrifugation en gradient de densité, l'ADN satellite se sépare en une bande distincte, car la composition en bases de l'ADN satellite est différente de celle de l'ADN en vrac. Une espèce peut avoir plus d'une séquence satellite comme chez Drosophila virilis qui a 3 séquences satellites de 7 nucléotides chacune.

L'ADN satellite est présent autour des centromères dans l'hétérochromatine centromérique. Chez l'homme, 3 blocs d'ADN satellite sont présents dans les constrictions secondaires des chromosomes 1, 9 et 16. Un quatrième bloc est présent à la partie distale du bras long du chromosome Y.

Ceux-ci se produisent généralement en grappes avec environ 3000 répétitions, leur taille allant de 12 à 100 pb de longueur. Les séquences minisatellites occupent des portions plus courtes du génome que les séquences satellites. Les minisatellites sont souvent instables et le nombre de copies de minisatellites peut augmenter ou diminuer d'une génération à l'autre. La longueur du locus du minisatellite pourrait varier au sein d'une même famille et dans la population (polymorphisme). Les changements dans les séquences des minisatellites peuvent affecter l'expression des gènes voisins.

Celles-ci comprennent les séquences les plus courtes d'une à cinq paires de bases de long, présentes en grappes d'environ 50 à 100 paires de bases de long. Ils sont dispersés uniformément dans l'ADN. Le génome humain contient environ 30 000 loci microsatellites différents. Les modifications du nombre de copies de certaines séquences microsatellites sont responsables de certaines maladies héréditaires.

2. Séquences d'ADN modérément répétées :

Ceux-ci sont partiellement redondants. Les séquences sont très similaires mais peuvent ne pas être identiques. Cette fraction comprend des séquences qui sont répétées dans le génome de quelques fois à des dizaines de milliers de fois. Les gènes des ARN et des histones sont de ce type. Ils constituent 15 % de l'ADN de la souris, 45 % du Xénope et 80 % du blé, de l'oignon et du saumon.

3. Séquences uniques ou à copie unique :

Ces séquences ne sont présentes qu'une seule fois dans le génome, ou au plus, en quelques exemplaires. Ils ont un faible taux de réassociation. La plupart des gènes de structure se trouvent parmi les séquences uniques. La souris contient 70 % et Xenopus environ 55 % de séquences à copie unique.

Séquences répétées dispersées:

Contrairement à l'ADN répété décrit ci-dessus dans lequel les séquences répétées sont regroupées en tandem, certaines séquences répétées sont dispersées dans tout le génome, appelées ADN dispersé ou intercalé, au lieu d'être regroupées en tant que répétitions en tandem. Des séquences répétées dispersées ont été étudiées dans de nombreux organismes.

Ce sont des familles de séquences répétées dispersées dans tout le génome avec une séquence d'ADN unique. Souvent, un petit nombre de familles ont un nombre de copies très élevé et constituent la majeure partie de l'ADN répété dispersé dans le génome. En général, on rencontre deux motifs d'interspersion qui permettent de classer ces séquences en SINE (courts éléments intercalés) ou en LINE (longs éléments intercalés).

Les familles de SINE ont des séquences d'environ 100 à 400 pb, tandis que les LINE ont environ 1000 à 7000 pb. Tous les organismes eucaryotes ont des LIGNES et des SINE, bien que leurs proportions relatives varient considérablement. La drosophile et les oiseaux ont principalement des LIGNES, les humains et les grenouilles ont principalement des SINE. Les LIGNES et les SINE représentent une proportion importante de tout l'ADN modérément répétitif du génome.

Les génomes diploïdes des mammifères ont environ 500 000 copies de la famille LINE-1 (L1) de séquences répétées représentant environ 15 % du génome. Les autres familles LINE sont beaucoup moins abondantes que LINE-1. Les membres de la famille LINE-1 pleine longueur ont une longueur de 6 à 7 kilos. Les éléments LINE-1 de pleine longueur sont des transposons, c'est-à-dire qu'ils codent pour des enzymes pour le mouvement de ces éléments dans le génome.

Un bon exemple de SINE sont les séquences Alu dans les génomes de mammifères, ainsi appelées parce qu'elles contiennent un seul site pour l'endonucléase de restriction Alu I. Les séquences Alu ont une longueur d'environ 300 paires de bases, et environ un million de ces séquences sont dispersées dans tout le génome, ce qui représente pour près de 10 % de l'ADN cellulaire total.

Les séquences Alu sont transcrites en ARN, mais elles ne codent pas pour les protéines, et leur fonction n'est pas connue. De manière significative, comme les séquences LINE-1, les séquences Alu sont également des éléments transposables et capables de se déplacer vers différents sites de l'ADN génomique si les enzymes nécessaires au mouvement sont fournies par des éléments LINE actifs.

Localisation in situ de l'ADN satellite:

Les emplacements précis des séquences d'ADN répétées sur les chromosomes eucaryotes ont été déterminés par la technique d'hybridation in situ, d'abord développée par Pardue et Gall (1970). La méthode est basée sur le fait que seuls les brins simples d'ADN/ADN ou d'ADN/ARN s'hybrident qui ont des séquences de bases complémentaires.

Les préparations cytologiques de propagations chromosomiques sont traitées avec du NaOH qui dissocie l'ADN. Les préparations sont incubées dans une solution contenant des molécules d'acide nucléique simple brin (soit de l'ADN soit de l'ARN transcrit), qui sont marquées au tritium. Les régions des chromosomes qui contiennent des séquences de bases complémentaires s'hybrident avec les séquences correspondantes dans des molécules simple brin. Leurs emplacements sont déterminés par autoradiographie.

En utilisant de l'ADN satellite de souris marqué, Pardue et Gall (1970) ont pu déterminer l'emplacement des séquences satellites dans l'hétérochromatine constitutive adjacente aux centromères des chromosomes mitotiques (Fig. 19.2c). À l'exception de Y, tous les chromosomes de souris restants ont un ADN satellite au niveau des centromères. Plus tard, de nombreux matériaux ont montré de l'ADN satellite dans l'hétérochromatine constitutive, celle qui forme des bandes C avec Giemsa.

Parfois, il peut y avoir plus d'un type d'ADN satellite dans un génome. Les chromosomes humains ont 4 sous-fractions satellites présentes dans les chromosomes 1, 9, 16 et Y. Toutes les 4 sous-fractions satellites s'hybrident avec le chromosome 9. Il est également intéressant du point de vue évolutif que toutes les sous-fractions satellites humaines s'hybrident avec le singe. et l'ADN de chimpanzé.


Deux brins d'ADN dénaturés peuvent-ils se réassocier ? - La biologie

Technologie d'hybridation

Acides nucléiques dénaturants

A ces interactions stabilisatrices s'oppose la répulsion électrostatique de
le squelette chargé sucre-phosphate.

Il existe deux approches de base pour dénaturer l'ADN double brin
- chauffage et traitement chimique.

Les dénaturants chimiques peuvent être divisés en trois classes

Avant de quitter le sujet de la dénaturation de l'ADN, regardons d'un peu plus près
Dénaturation thermique.
Considérez ce qui se passe lorsque nous chauffons une solution d'acide nucléique - disons le génome d'E. coli. Pour préparer l'ADN pour cette expérience, nous le cisaillons en petits morceaux (environ 500 pb de long) et le chauffons lentement tout en surveillant l'A260.

L'A initial260 est stable jusqu'à ce que, sur un intervalle d'environ 5 degrés C, le A260 augmente soudainement d'environ 40 %.

Cette augmentation de l'absorbance est appelée
Décalage hyperchromique.

Le décalage hyperchromique est dû à la fusion de la double hélice en deux simples brins. L'augmentation de la liberté de rotation des bases N lors de la séparation des brins explique l'augmentation observée de l'absorbance.

Les température de fusion , ou Tm , est la température au milieu du décalage hyperchormique comme indiqué à gauche.

Trois facteurs principaux affectent la température de fusion.

Les Contenu du GC de l'échantillon d'acide nucléique.
Cela est dû au fait que les paires de bases AT partagent 2 liaisons H tandis que les paires de bases GC partagent 3 liaisons H.

[sel]
Tm est sensible à la concentration en Na+.
Na + agit pour empêcher les charges négatives du squelette sucre-phosphate d'interagir les unes avec les autres. La répulsion entre les squelettes phosphates chargés négativement est la principale force déstabilisant la double hélice, donc l'augmentation de la concentration en Na + augmente la stabilité de l'hélice et la diminution de la concentration en Na + diminue la stabilité de l'hélice.

longueur hybride d'ADN
Plus l'hybride d'ADN est long, plus il y a de liaisons H maintenant les deux brins ensemble. Plus l'hybride est long, plus il faut rompre simultanément les liaisons H pour que les deux brins se séparent.
C'est ce qu'on appelle « l'effet fermeture éclair » d'après le (in) célèbre inventeur canadien Zippy. Pour nos besoins, nous ne considérerons que les deux extrêmes de l'effet de fermeture à glissière. Pour ce cours, nous ne considérerons que les extrêmes de longueur des hybrides - les hybrides de moins de 50 pb (courts) et ceux d'environ 500 pb (longs) de longueur.


Deux brins d'ADN dénaturés peuvent-ils se réassocier ? - La biologie

La dénaturation de l'ADN, le réannelage, l'hybridation sont des processus basés sur la chimie de l'appariement de bases entre les brins complémentaires de la double hélice d'ADN.

Les deux brins d'ADN double hélice rester ensemble via appariement de bases de bases azotées: adénine, thymine, guanine et cytosine. N'oubliez pas que l'adénine (A) établit deux liaisons hydrogène avec la thymine (T), tandis que la guanine (G) forme trois liaisons hydrogène avec la cytosine (C). Lorsque ces liaisons hydrogène se rompent, la double hélice fond et génère deux brins simples. Ce processus est appelé dénaturation de l'ADN (ou fusion de l'ADN). Les températures élevées et certains produits chimiques induisent la dénaturation de l'ADN. Comme il y a plus de liaisons hydrogène entre les paires de bases G et C que les paires de bases A et T, plus un brin d'ADN a de paires de bases G-C, plus la température de fusion est élevée.

Heureusement, la dénaturation de l'ADN est un processus réversible. Lorsque la température se refroidit lentement, des brins simples complémentaires se réunissent et forment des liaisons hydrogène appropriées. À la suite de cela recuit processus, les deux brins simples se recombinent pour former la double hélice.

Cependant, dans un état simple brin, l'ADN pourrait se lier à un autre ADN simple brin d'origine différente s'ils présentent une complémentarité suffisante ou un appariement de bases suffisant. C'est ce qu'on appelle l'acide nucléique hybridation.

Questions pratiques

Académie Khan

Préparation officielle MCAT (AAMC)

Section Banque C/P Section Passage 9 Question 70

Flashcards en ligne Biochimie Question 5

Pack de questions sur la biologie, Vol 2. Passage 9 Question 58

• La dénaturation de l'ADN est le déroulement de la double hélice à des températures plus élevées ou dans des conditions chimiques extrêmes.

• Lorsque ces conditions redeviennent favorables, la double hélice d'ADN se forme à nouveau dans un processus de réannelage.

• Les brins d'ADN ne sont pas totalement fidèles les uns aux autres : ils peuvent s'hybrider, c'est-à-dire former des doubles brins avec d'autres brins complémentaires.

Dénaturation de l'ADN :Fait référence à la fusion d'ADN double brin pour générer deux brins simples.

Bases azotées : Molécules organiques, qui font partie des nucléotides de l'ADN, présentant des propriétés chimiques semblables à celles d'une base.

Appairage de bases: La manière spécifique dont les bases de l'ADN s'alignent et se lient les unes aux autres A toujours avec T et G toujours avec C.

Double hélice: La structure de l'ADN qui ressemble à un escalier torsadé.

Hybridation: L'appariement spontané d'une séquence d'ADN complémentaire par liaison hydrogène pour créer une molécule double brin.


Échantillon

Expérience (B1-1). Propriétés de l'ADN
Informations d'arrière-plan
L'ADN est une molécule extrêmement longue qui est très mince, mais assez rigide. L'isolement de molécules d'ADN intactes à partir d'une cellule est difficile en raison de la facilité relative avec laquelle ces longues molécules en forme de bâtonnets peuvent être brisées. Même l'injection d'une solution d'ADN à travers l'aiguille d'une seringue hypodermique peut provoquer une dégradation importante des molécules d'ADN. L'ADN peut également être décomposé par des enzymes appelées désoxyribonucléases. La désoxyribonucléase I (ADNase I), une enzyme isolée du pancréas de mammifère, sera utilisée dans l'expérience d'aujourd'hui. Cette enzyme rompt les liaisons phosphodiester qui relient les unités nucléotidiques de l'ADN, dégradant les longues molécules d'ADN en un mélange de petites chaînes nucléotidiques, comme illustré à la figure 1-1.

Une molécule d'ADN est composée de deux chaînes polynucléotidiques enroulées l'une autour de l'autre pour former une double hélice rigide (voir page 4). La structure en double hélice de l'ADN est très stable à température ambiante car les liaisons hydrogène et hydrophobes entre les bases empilées maintiennent les deux chaînes polynucléotidiques ensemble. Cependant, si une solution d'ADN est chauffée à une température critique, ces liaisons sont rompues et les deux brins polynucléotidiques se séparent par un processus appelé dénaturation. La dénaturation de l'ADN s'accompagne d'une diminution de la viscosité (épaisseur) de la solution car les molécules d'ADN simple brin forment des structures enroulées flexibles qui ne conservent plus la structure native rigide de la double hélice d'ADN (Figure 1-2). Si l'ADN est refroidi rapidement, les molécules resteront sous forme de polynucléotides simple brin. Cependant, si la solution est refroidie très lentement, la restauration de l'hélice d'ADN se produira. Le réassemblage des deux brins polynucléotidiques séparés est appelé renaturation.

Les macromolécules telles que l'ADN, l'ARN et les protéines ne sont pas solubles dans les solutions d'alcool et précipitent (sortent de la solution) lors de l'ajout d'alcool. En général, les protéines globulaires et l'ARN forment de fins précipités non fibreux dans l'alcool. En revanche, les molécules d'ADN en forme de bâtonnets précipitent dans l'alcool sous forme de longues fibres qui peuvent être enroulées sur un bâtonnet de verre. La capacité de l'ADN à former des fibres dans l'alcool dépend des propriétés physiques des molécules d'ADN. Par exemple, l'ADN qui a été brisé en petits morceaux par digestion à la DNAse I ne formera pas de fibres, pas plus que l'ADN simple brin qui a été préparé par dénaturation thermique de la double hélice d'ADN. Ces propriétés de l'ADN seront illustrées dans les expériences d'aujourd'hui.


Questions d'étude et analyse

1. Décrire les propriétés de base de l'ADN qui sont responsables de la formation de fibres lorsque de l'alcool est ajouté à une solution contenant de l'ADN natif (double brin).
2. Describe the type of precipitate that is formed when alcohol is added to denatured (single stranded) DNA. Offer an explanation as to why this precipi¬tate is different from that which is observed with native DNA.
3. Describe the action of DNAse Ion DNA and relate this effect to the results of your experiment in Section HI.


Sommaire

  • Reassociation kinetics defines different classes of DNA in genomes: single copy, middle repetitive and highly-repetitive
  • Reassociation kinetics makes it possible to determine the fraction of a genome in each kinetic class, and which transcripts are produced from each class

Authors: Dr. B. Fristensky and N. Brien

Unless otherwise cited or referenced, all content on this page is licensed under the Creative Commons License Attribution Share-Alike 2.5 Canada


Voir la vidéo: LADN et les informations génétiques - SVT Seconde - Les Bons Profs (Mai 2022).