Informations

Ajout de la voie Propionyl-CoA à E.coli

Ajout de la voie Propionyl-CoA à E.coli


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

J'essaie donc de simuler la production d'acide 3-hydroxypropionique avec E.coli via la voie Propionyl-CoA. Cependant, je ne sais pas vraiment comment se passe la production dans le parcours. J'ai l'image suivante :

Si je comprends bien, la voie va : Acetyl-Coa--> Propionate --> Propionyl-CoA -->… --> 3-HP Lors de l'ajout de ces réactions dans Cobra, les coefficients stoechiométriques sont-ils toujours de 1 ?


Source de la figure : Luo H, Zhou D, Liu X, Nie Z, Quiroga- Sánchez DL, Chang Y (2016) Production of 3-Hydroxypropionic Acid via the Propionyl-CoA Pathway Using Recombinant Escherichia coli Souches. PLoS ONE 11(5) : e0156286. doi: 10.1371/journal. pone.0156286


Si je comprends bien, la voie va : Acetyl-CoA --> Propionate --> Proprionyl-CoA -->… --> 3-HP

Pas exactement. La première réaction est : $propionate + acétyl extrm-CoA ightarrow propionyl extrm-CoA + acétate$ Le groupe CoA est transféré de l'acétate au propionate. Les réactions suivantes sont une oxydation en acryloyl-CoA et une hydratation subséquente en 3-HP-CoA. Enfin, le groupe CoA est transféré de nouveau à l'acétate.

Le propionate est une molécule à 3 carbones, tout comme le 3-HP. Les coefficients stoechiométriques de 1 semblent donc logiques.


Propionyl-CoA:succinate CoA transférase

<p>Le score d'annotation fournit une mesure heuristique du contenu d'annotation d'une entrée UniProtKB ou d'un protéome. Ce score <strong>ne peut pas</strong> être utilisé comme mesure de l'exactitude de l'annotation car nous ne pouvons pas définir la « bonne annotation » pour une protéine donnée.<p><a href='/help/annotation_score' target='_top'> Suite. </a></p> - Preuve expérimentale au niveau de la protéine i <p>Ceci indique le type de preuve qui soutient l'existence de la protéine. Notez que la preuve « existence de protéines » ne donne pas d'informations sur l'exactitude ou l'exactitude de la ou des séquences affichées.<p><a href='/help/protein_existence' target='_top'>Plus. </a></p>

Sélectionnez une section sur la gauche pour voir le contenu.


Résumé

Nous avons déjà signalé in vivo biosynthèse de polyesters contenant de l'acide 2-hydroxy, y compris l'acide polylactique (PLA), le poly(3-hydroxybutyrate-co-lactate) [P(3HB-co-LA)], et poly(3-hydroxybutyrate-co-2-hydroxybutyrate-co-lactate) [P(3HB-co-2HB-co-LA)] employant métaboliquement Escherichia coli souches par l'introduction de Clostridium propionicum propionyl-CoA transférase (PctCp) et Pseudomonas sp. MBEL 6-19 polyhydroxyalcanoate (PHA) synthase 1 (PhaC1PS6–19). Dans cette étude, nous avons approfondi in vivo Système de biosynthèse du PLA dans E. coli pour synthétiser du PHA contenant du 2HB, dans lequel le propionyl-CoA a été utilisé comme précurseur du 2-cétobutyrate qui a été converti en 2HB-CoA par les actions séquentielles de Lactococcus lactis ( d )-2-hydroxybutyrate déshydrogénase (PanE) et PctCp puis 2HB-CoA a été polymérisé par PhaC1PS6–19. Le recombinant E. coli XL1-bleu exprimant le phaC1437 gène, le pct540 gène, et le Ralstonia eutropha prpE gène avec le vitre gène a pu être cultivé à 0,66 g/L et produit avec succès P(70 mol%3HB-co-18 mol%2HB-co-12 mol%LA) jusqu'à la teneur en PHA de 66% en poids à partir de 20 g/L de glucose, 2 g/L de 3HB et 1 g/L de propionate de sodium. Suppression de la prpC gène dans le chromosome de E. coli XL1-blue pourrait augmenter la fraction molaire de 2HB dans le copolymère, mais la teneur en PHA a été diminuée.

La stratégie d'ingénierie métabolique rapportée ici suggère que le propionyl-CoA peut être utilisé avec succès comme précurseur pour fournir de la PHA synthase avec 2HB-CoA pour la production de PHA contenant le monomère 2HB.


Le poly(3-hydroxypropionate) [poly(3HP)] est un monomère prometteur de la famille des polyhydroxyalcanoates (PHA) aux propriétés matérielles similaires à d'autres PHA à chaîne courte (SCL) comme le poly(3-hydroxybutyrate) [poly(3HB)]. Il s'agit d'un polyester bien caractérisé, biodégradable, biocompatible et doté d'excellentes propriétés mécaniques telles qu'une flexibilité élevée, une résistance à la traction élevée et une rigidité élevée, mais plus stable que l'acide polylactique (Andree෾n et al., 2010, 2014b). La biosynthèse des homopolymères poly (3HP) a été mise à l'honneur en 2010, en utilisant le glycérol comme source de carbone dans une fermentation en deux étapes, et s'est avérée être une alternative prometteuse au plastique dérivé de la pétrochimie.

En un demi-siècle, le glycérol, un sous-produit de la production de biodiesel, est devenu une source de carbone commune pour plusieurs recherches biotechnologiques dans le monde. En raison de la pollution de l'environnement associée à l'industrie pétrochimique entraînant le changement climatique et la surexploitation des réserves fossiles, il est nécessaire d'utiliser des approches biologiques via l'ingénierie métabolique pour produire de nombreux produits chimiques à partir de sources non renouvelables en utilisant des matières premières peu coûteuses et abondantes (Keasling, 2010).

L'efficacité et le succès de la production biologique d'une plate-forme chimique comme l'acide 3-hydroxypropoïque (3-HP) dépendent du développement d'usines cellulaires microbiennes, ce qui a incité des recherches vigoureuses et approfondies menées dans divers domaines tels que la biosynthèse, l'amplification génique, l'ingénierie de enzymes, conception du circuit génétique, édition du génome, bioinformatique, évolution adaptative en laboratoire, multiomique utilisant des hôtes appropriés et voies biosynthétiques des micro-organismes à travers le processus appelé cycles de conception-construction-test-apprentissage (DBTL)” (Li et al., 2012 Abatemarco et al., 2013 Cheong et al., 2015 Wu et al., 2016). De plus, pour commercialiser ces processus via des voies de biosynthèse efficaces pour obtenir des produits économiquement viables, les biocapteurs doivent être construits selon une voie métabolique appropriée, optimisée pour produire des résultats souhaitables (Liu et al., 2015a).

Afin d'augmenter les rendements de PHA grâce à la biotechnologie synthétique et à l'ingénierie métabolique, des biocapteurs de métabolites ont été utilisés pour détecter et surveiller un métabolite cible. in vivo par criblage à haut débit (HTS) (Eggeling et al., 2015). Bien que les articles de revue précédents aient discuté de certaines voies biosynthétiques, des caractéristiques matérielles et chimiques du poly(3HP) (Andree෾n et al., 2014b Chang et al., 2018), cependant, cette revue discute abondamment à jour les voies métaboliques qui peuvent être utilisé pour produire du poly(3HP) à partir de glycérol et de glucose. L'article se concentre également sur l'hôte de production, l'utilisation de biocapteurs malonyl-CoA pour optimiser le rendement, l'évaluation du cycle de vie pour la production de poly(3HP) utilisant l'huile de maïs comme source de carbone, et les propriétés physiques et chimiques. Enfin, nous soulignerons quelques applications de poly(3HP).

Les polyhydroxyalcanoates sont des classes de polyesters de stockage bactériens aliphatiques intracellulaires et linéaires de haut poids moléculaire, qui sont des thermoplastiques biocompatibles et biodégradables en dioxyde de carbone et en eau par de nombreux micro-organismes (Zhang et al., 2018). Les propriétés physiques ou matérielles des PHA sont similaires à celles des plastiques dérivés du pétrole, mais présentent des caractéristiques différentes allant de la fragilité à la flexibilité et à l'élasticité, comme le montre le tableau 1 (Muhammadi et al., 2015). L'exposition des polymères PHA à des caractéristiques telles que l'élasticité, la flexibilité, la biodégradabilité et le renouvellement dépendent fortement de ces facteurs, à savoir (1) leurs voies de production de biosynthèse (Masood et al., 2014), (2) la composition monomère (Luzi et al. , 2019) et (3) la structure chimique (Bugnicourt et al., 2014).

Tableau 1. Comparaison des propriétés thermodynamiques du poly (3-HP) par rapport à d'autres copolymères de PHA.

De plus, la production de PHA n'est actuellement pas économique par rapport à celle des plastiques synthétiques. Pour rendre la production de PHA bactériens rentable, quelques facteurs critiques doivent être pris en compte, tels que le criblage et la sélection de souches bactériennes potentielles (Kumar et al., 2016, 2020), les voies de synthèse, les outils et technologies avancés (Mo៎jko- Ciesielska et Mostek, 2019), une source de carbone et d'azote (Zahari et al., 2014) et des processus en aval rentables (Koller et Braunegg, 2018). L'application ciblée des PHA est également un facteur crucial déterminant son importance et son économie (Chen et al., 2017 Cao et al., 2019).

De nombreux chercheurs ont récemment orienté leur intérêt vers la production de PHA en raison des sources de carbone peu coûteuses comme substrat et du problème dangereux associé à l'élimination des déchets plastiques à usage unique (Chen et Patel, 2012).

Auparavant, la polymérisation par ouverture de cycle (ROP) de la β-propiolactone et la condensation de l'ester 3-HP étaient les processus chimiques de synthèse du poly(3HP). Il n'y a eu aucune preuve d'un organisme naturel capable de le synthétiser (Wang et al., 2012, 2013 Heinrich et al., 2013).

Cependant, le poly(3HP) n'était pas commercialement faisable à produire en grandes quantités car la β-propiolactone en tant que substrat a des propriétés cancérigènes (Dunn, 2012 Dunn et al., 2016). Le 3-HP, qui a une faible cristallinité, est un précurseur idéal qui forme un constituant pour plusieurs copolymères comme le poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxypropionate) [poly(3HB-co-3HP)] ou le poly(3-hydroxypropionate- co-4-hydroxybutyrate) [Poly (3HP-co-4HB)] (Zhou et al., 2011 Wang et al., 2013).

L'acide 3-hydroxypropoïque, l'acrylate et le 1,3-propanediol (1,3-PDO) étaient auparavant utilisés comme précurseurs dépendants pour la biosynthèse du poly(3HP) et du copolymère contenant du 3-HP (Gao et al., 2014). Cependant, ces précurseurs coûteux et la vitamine B12 augmentation du coût de production du poly (3HP) le rendant économiquement impossible.

Des voies artificielles ont été construites pour la biosynthèse du poly(3HP) à partir de sources de carbone peu coûteuses telles que le glucose et le glycérol sans ajout de précurseurs pour remédier aux défis posés par les coûts de production élevés (Andree෾n et al., 2010). Néanmoins, seulement 13 mg/L de poly(3HP) ont été produits par recombinaison Escherichia coli souche utilisant le glucose comme substrat. Andrée෾n et al. (2010) ont produit 1,42 mg/L de poly(3HP) par conversion de glycérol à l'aide d'un E. coli souche portant la glycérol déshydratase de Clostridium buytricum DhaB1Cb, la propionaldéhyde déshydrogénase de Salmonella enterica sérovar Typhimurium LT2 (PduPSe) et le gène de la PHA synthase de Ralstonia eutropha HI6 (PhaC1Re) dans un processus de fermentation fed-batch en deux étapes (Andree෾n et al., 2010).


RÉSULTATS

Identification du gène putatif de la mésaconyl-CoA hydratase.

Travaux antérieurs sur la nouvelle voie d'assimilation de l'acétate dans R. sphaeroides identifié un gène essentiel qui code pour une enzyme du (RFamille )-énoyl-CoA hydratase (2). Des gènes similaires ont été trouvés dans d'autres bactéries qui ont en commun avec R. sphaeroides l'absence de cycle fonctionnel du glyoxylate pour l'assimilation de l'acétate. Cependant, l'identité de séquence globale de ces protéines avec le membre caractérisé de cette famille dite MaoC ou FkbR2, ​​un R-spécifique 3-hydroxyacyl-CoA déshydratase de Aeromonas caviae (18), n'est que de l'ordre de 20%. De plus, la masse moléculaire attendue de l'enzyme codée est d'environ 38 kDa, ce qui est supérieur aux masses des énoyl-CoA hydratases normales (14 à 28 kDa). Un gène similaire a été trouvé dans C. aurantiacus à côté du gène codant pour la l-malyl-CoA/β-méthylmalyl-CoA lyase. Les produits génétiques de C. aurantiacus et R. sphaeroides avait 58% séquences d'acides aminés identiques. Ils ont montré deux domaines d'hydratase, qui ne présentaient que 25 % d'identité au niveau des acides aminés. Normalement, les énoyl-CoA hydratases ne contiennent qu'un seul de ces domaines. Cela suggère une duplication des gènes et explique également la plus grande taille des sous-unités par rapport aux autres énoyl-CoA hydratases.

Clonage et expression.

Le putatif 1.06-ko Chloroflexus gène de mésaconyl-CoA hydratase codé pour une protéine de 38 kDa (352 acides aminés), et le gène de 1,02 kb Rhodobacter gène codé pour une protéine de 37 kDa (343 acides aminés). Les gènes des deux bactéries ont été amplifiés et les produits de PCR attendus ont été clonés dans le vecteur d'expression pET16b, aboutissant au codage de His N-terminal10-protéines marquées avec des masses moléculaires altérées d'environ 40 kDa. Les deux plasmides ont été transformés en E. coli DH5α puis transformé en E. coli BL-21(DE3) pour l'expression. A titre de contrôle, le vecteur d'expression sans insert a également été transformé. Les deux gènes étaient exprimés de manière hétérologue et les enzymes étaient solubles, comme déduit d'une bande de protéine induite autour de 40 kDa en SDS-PAGE de la fraction cellulaire soluble (Fig. ​ (Fig.2 2).

Dénaturation PAGE (12,5&# x00025) de diverses étapes de purification de la mésaconyl-CoA hydratase exprimée de manière hétérologue de C. aurantiacus et R. sphaeroides à partir d'extraits de 3 g E. coli cellules. Pistes 1 et 7, étalons de masse moléculaire pistes 2 à 4, Chloroflexus enzyme piste 2, extrait (100 000 × g surnageant) d'induit E. coli cellules (45 μg protéine) piste 3, fraction de précipitation thermique (20 μg protéine) piste 4, fraction de chromatographie d'affinité (8 μg protéine) pistes 5 et 6, Rhodobacter enzyme piste 5, extrait (100 000 × g surnageant) d'induit E. coli cellules (protéine 30 μg) piste 6, fraction de chromatographie d'affinité (protéine 8 μg). Le gel a été coloré au bleu brillant de Coomassie R-250.

Dosage enzymatique spectrophotométrique.

La l-malyl-CoA/β-méthylmalyl-CoA lyase recombinante de C. aurantiacus a été utilisé dans un essai spectrophotométrique couplé pour convertir enzymatiquement le propionyl-CoA et le glyoxylate en β-méthylmalyl-CoA, le substrat de la mesaconyl-CoA hydratase/β-méthylmalyl-CoA déshydratase postulée. La transformation ultérieure du β-méthylmalyl-CoA en d'autres thioesters de la coenzyme A a été testée avec E. coli extraits contenant de la mésaconyl-CoA hydratase putative surproduite. Les deux extraits, qui contenaient soit le Chloroflexus ou la Rhodobacter produit du gène, a catalysé une réaction associée à une augmentation de l'absorbance au-dessus de 260 nm, avec un maximum à environ 284 nm. Parce que l'absorption des protéines interférait à cette longueur d'onde, nous avons utilisé 290 nm pour suivre la réaction par spectrophotométrie (Fig. ​ (Fig.3). 3). La réaction dépendait du propionyl-CoA, du glyoxylate et de la l-malyl-CoA/β-méthylmalyl-CoA lyase. En revanche, les extraits de type sauvage E. coli ou de E. coli portant le plasmide sans insert étaient inactifs.

Spectres UV de la coenzyme A ( .._.. ), le propionyl-CoA (—), le β-méthylmalyl-CoA (—) et le produit de la réaction d'hydratase, le mésaconyl-CoA ( ……. ). Les spectres ont été enregistrés en 40 mM K2HPO4/tampon acide formique, pH 4,2 et ont été normalisés à la même absorption à 260 nm.

Confirmation d'une activité enzymatique de transformation du β-méthylmalyl-CoA.

L'analyse HPLC a révélé que le β-méthylmalyl-CoA était presque complètement consommé et qu'un nouveau produit s'était formé (Fig. ​ (Fig.4). 4). À l'équilibre, le rapport des concentrations de β-méthylmalyl-CoA au produit était proche de 1:10. Le produit avait toujours l'absorbance maximale des nucléotides d'adénine à 260 nm caractéristique du CoA, du propionyl-CoA ou du β-méthylmalyl-CoA. Cependant, il avait un épaulement d'absorbance supplémentaire à des longueurs d'onde plus longues (Fig. ​ (Fig.3). 3). Le coefficient d'absorption molaire estimé à 290 nm de ce produit (très probablement le mésaconyl-CoA) était de 2 350 M 𢄡 cm 𢄡 , celui du substrat β-méthylmalyl-CoA était de 200 M 𢄡 cm 𢄡 , et celle du propionyl-CoA était d'environ 200 M 𢄡 cm 𢄡 . Cette estimation est basée sur l'hypothèse que les coefficients d'absorption molaires à 260 nm (ɛ260) du substrat et du produit sont très similaires à celui des esters de CoA normaux, tels que l'acétyl-CoA (16 400 M 𢄡 cm 𢄡 à titre de comparaison, le ɛ260 de CoA est de 16 800 M 𢄡 cm 𢄡 ) (11). Le Δɛ290 (mésaconyl-CoA moins β-méthylmalyl-CoA) de 2 150 M 𢄡 cm 𢄡 a été utilisé pour quantifier la consommation de β-méthylmalyl-CoA et la réaction de formation de produit dans le test spectrophotométrique.

Séparation HPLC du [ 14 C]mésaconyl-CoA en tant que produit de la mésaconyl-CoA hydratase à partir du [ 14 C]β-méthylmalyl-CoA et du [ 14 C]propionyl-CoA. Le [ 14 C]β-méthylmalyl-CoA est formé enzymatiquement à partir de [ 14 C]propionyl-CoA et de glyoxylate avec la l-malyl-CoA/β-méthylmalyl-CoA lyase recombinante. Le CoA et ses dérivés ont été détectés à 260 nm. Les acides libres des thioesters de CoA correspondants ont été élués entre 2 et 5 min. (A) Avant l'ajout de glyoxylate au mélange d'essai. (B) Dix minutes après l'ajout de glyoxylate. (C) Formation de mésaconyl-CoA après encore 10 minutes d'incubation avec de la mésaconyl-CoA hydratase recombinante. Les sensibilités de la détection du 14 C par comptage à scintillation en phase solide dans les différentes analyses étaient les mêmes et, par conséquent, les signaux peuvent être directement comparés. Pour les conditions, voir Matériels et méthodes.

Activité enzymatique dans l'extrait cellulaire de C. aurantiacus.

Utilisation de quantités excessives de l-malyl-CoA/β-méthylmalyl-CoA lyase recombinante de C. aurantiacus, des concentrations saturantes de [ 14 C]propionyl-CoA et un excès de glyoxylate, l'activité spécifique du système enzymatique qui a produit du mésaconyl-CoA marqué à partir de propionyl-CoA marqué dans un extrait cellulaire de C. aurantiacus pourrait être estimé (55ଌ). L'activité enzymatique spécifique dans les extraits de cellules autotrophiques s'élevait à 20 à 30 nmol min 𢄡 mg de protéine 𢄡 , selon le lot de cellules. L'activité enzymatique spécifique était 10 à 15 fois plus faible dans les cellules à croissance hétérotrophe.

Purification d'enzymes recombinantes.

La plupart des protéines surproduites dans E. coli était dans la fraction cellulaire soluble, et la purification a commencé à partir des 100 000 × g surnageant. Pour le recombinant Chloroflexus enzyme, E. coli l'extrait a été chauffé pendant 10 min à 70°C, l'enzyme de ce thermophile modéré est restée active et dans le surnageant (Fig. ​ (Fig.2). 2). Le surnageant (ou extrait cellulaire dans le cas du recombinant Rhodobacter enzyme) a ensuite été chromatographié sur une colonne d'affinité haute performance Ni-Sepharose. A partir de 3g E. coli cellules (poids humide), 6,4 mg de Chloroflexus enzyme avec un rendement de 87% ou 4 mg de Rhodobacter enzyme avec un rendement de 52% a été obtenu (tableau ​ (tableau 1 1 ).

TABLEAU 1.

Purification de la mésaconyl-CoA hydratase recombinante marquée par His de C. aurantiacus et R. sphaeroides à partir de 3 g de E. coli cellules une

Étape de purificationActivité enzymatique totale (μmol min 𢄡 )Protéines totales (mg)Sp act (μmol min 𢄡 mg de protéine 𢄡 )Récupération (%)Purification (pli)
Extrait cellulaire−/10,500106−/99−/100−/1
Précipitation de chaleur9 300/−16.5/−560/−100/−1−
Ni-Sepharose haute performance8,100/5,5006.4/4.01,300/1,40087/522.3/14.0

Propriétés des mésaconyl-CoA hydratases.

L'activité spécifique du Chloroflexus l'enzyme à 55ଌ était de 1 300 μmol min 𢄡 mg 𢄡 , et celle de la Rhodobacter l'enzyme à 30 °C était de 1 400 μmol min 𢄡 mg 𢄡 . Le chiffre d'affaires enzymatique par enzyme dimère basé sur des activités spécifiques pour le Chloroflexus enzyme était de 1700 s 𢄡 , et que pour le Rhodobacter l'enzyme était de 1900 s 𢄡 . Les deux enzymes ont présenté une activité optimale à pH 7,5 et une activité semi-maximale à pH 6,5 et 8,5 (données non présentées). Les spectres UV des enzymes ont montré des absorptions seulement à 280 nm. SDS-PAGE a révélé que les enzymes étaient composées de sous-unités d'environ 40 kDa. La filtration sur gel a indiqué une masse moléculaire des enzymes natives d'environ 80 kDa, suggérant une structure homodimérique.

Isolement et élucidation de la structure du produit de la transformation du β-méthylmalyl-CoA marqué au 13C en mésaconyl-CoA.

Le produit enrichi en 13 C de la conversion du [1,2, 3- 13 C]propionyl-CoA et du glyoxylate par la l-malyl-CoA/β-méthylmalyl-CoA lyase recombinante et la mésaconyl-CoA hydratase recombinante de C. aurantiacus ou R. sphaeroides a été analysé par HPLC-MS. Le produit avait une masse moléculaire virtuelle de 877,9 Da, telle que déterminée par ESI-MS (mode ion négatif). Cela correspond à une masse moléculaire de 878,9 Da, ce qui est proche de la valeur attendue de 878,6 Da pour le mésaconyl-CoA.

Le produit a été isolé par HPLC et analysé par spectroscopie RMN unidimensionnelle et bidimensionnelle. Le mésaconyl-CoA a été caractérisé par des signaux RMN du proton à 0,87 ppm (s, 3H, 10″ CH3), 1.10 (s, 3H, 11″ CH3), 2,26 (jjj, J = 130,0 Hz, 5,8 Hz, 1,5 Hz, 3H, ʬH3 [mésaconyle]), 2,46 (m, 2H, H6″), 3,13 (q, J = 6,5 Hz, 2H, H9″), 3,40 (t, J = 6,4 Hz, 2H, H8″), 3,51 (t, J = 6,8 ​​Hz, 2H, H5″), 3,64 (m, 1H, H1𠌺), 4,06 (m, 1H, H1𠌻), 4,11 (s, 1H, H3″), 4,32 (s, br, 2H, H5′), 4,51 (s, br, 1H, H4′), 4,91 (m, 1H, H2′), 5,01 (s, br, 1H, H3′), 6,16 (d, J = 5,8 Hz, 1H, H1′), 6,70 (“t,” br, J = 8,0 Hz, 1H [mésaconyle]), 8,24 (s, 1H, H2), 8,61 (s, 1H, H8). Les carbones enrichis en 13 C (C1, C2 et α-méthyl) du mésaconyl-CoA ont donné des signaux à 14,3 ppm (dd, J = 42,6 Hz, 2,3 Hz), 149,4 (jj, J = 55,5 Hz, 42,6 Hz) et 195,3 (jj, J = 55,5 Hz, 2,3 Hz), indiquant l'incorporation de la chaîne carbonée intacte enrichie en propionyle 13C. Le signal correspondant dans la RMN du proton à 2,26 ppm du groupe α-méthyle enrichi en 13 C (RMN 13 C, 14,3 ppm) a été identifié par une expérience de cohérence quantique simple hétéronucléaire à gradient. De plus, le signal à 6,70 ppm (RMN du proton, β-CH) a montré un pic croisé avec les trois signaux à 14,3, 149,4 et 195,3 ppm (RMN 13 C) dans l'expérience de corrélation de liaisons multiples hétéronucléaires, vérifiant la structure mésaconyl-CoA. Le CH2 groupe à 3,13 ppm (RMN du proton) a donné un pic croisé avec le carbonyl-C enrichi en 13 C à 195,3 ppm (RMN 13 C) dans l'expérience de corrélation de liaisons multiples hétéronucléaires, vérifiant que le résidu CoA était attaché à C-1 de mésaconyl-CoA.


Résumé

Les Escherichia coli Le génome code pour sept paralogues de la superfamille des crotonases (enoyl CoA hydratase). Quatre d'entre eux ont des fonctions inconnues ou incertaines, leur existence était inconnue avant l'achèvement de la E. coli projet de séquençage du génome. Le gène codant pour l'un d'entre eux, YgfG, est situé dans un opéron à quatre gènes qui code pour des homologues de méthylmalonyl CoA mutases (Sbm) et d'acyl CoA transférases (YgfH) ainsi qu'une protéine kinase putative (YgfD/ArgK). Nous avons déterminé que YgfG est la méthylmalonyl CoA décarboxylase, YgfH est la propionyl CoA:succinate CoA transférase et Sbm est la méthylmalonyl CoA mutase. Ces réactions sont suffisantes pour former un cycle métabolique par lequel E. coli peut catalyser la décarboxylation du succinate en propionate, bien que le contexte métabolique de ce cycle soit inconnu. L'identification de YgfG en tant que méthylmalonyl CoA décarboxylase élargit la gamme de réactions catalysées par les membres de la superfamille des crotonases.

Cette recherche a été soutenue par l'Universität Karlsruhe, la Deutsche Forschungsgemeinschaft et le Fonds der Chemischen Industrie (à J.R.) et les subventions NIH GM-40570 et GM-52594 (à J.A.G.).

Adressez la correspondance à cet auteur. Téléphone : 217-333-3945. Télécopieur : 217-265-0385. Courriel : [e-mail protected]


Conclusions et perspectives futures

La commercialisation des méthodes de production de combustibles gazeux d'origine biologique est cruciale pour relever les défis mondiaux de la réalisation d'approvisionnements en énergie renouvelable et de la réduction de l'empreinte carbone et d'autres polluants. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour développer une production d'alcanes réglable sur tout le spectre des hydrocarbures à chaîne courte à très longue, convertissant efficacement les micro-organismes en « champs pétrolifères du futur ». Cela satisfera la demande de mélange avec, voire de remplacement, la dépendance actuelle vis-à-vis des carburants à base de pétrole et des précurseurs synthétiques.

La transition d'une recherche de « preuve de principe » à une commercialisation réussie nécessite une compréhension détaillée des facteurs technico-économiques associés à la mise à l'échelle des processus biologiques. Une étude récente sur le potentiel commercial de la production de gaz alcane par fermentation a identifié les paramètres clés qui nécessitaient une optimisation pour permettre une production de carburant rentable et a proposé des mesures d'atténuation pour surmonter ces obstacles [6]. Ces mesures d'atténuation comprenaient la transition vers des micro-organismes industriels robustes nécessitant des coûts d'investissement et de fonctionnement considérablement réduits, l'approvisionnement en sources d'énergie renouvelables et à faible coût, et l'augmentation des titres de production de gaz. Ce dernier est particulièrement important pour la production biologique d'alcanes car l'étape terminale de déformylation/décarboxylation dépendante de l'ADO/CvFAP est considérée comme l'étape limitant la vitesse.

L'identification des obstacles importants au succès commercial peut aider à orienter les recherches futures, par exemple pour améliorer l'efficacité biocatalytique in vivo, en appliquant des stratégies d'évolution ou de reconception d'enzymes pour augmenter les taux de réaction, la stabilité et l'expression dans un châssis choisi. L'avènement des techniques de biologie synthétique permet une optimisation plus approfondie du développement des procédés au-delà de la reconception traditionnelle des enzymes. Des améliorations de la productivité peuvent être obtenues en optimisant les parties régulatrices de l'ADN [74], à la fois au niveau transcriptionnel et traductionnel [75, 76], l'ingénierie métabolique des voies d'approvisionnement auxiliaires pour soulager les goulots d'étranglement et l'élimination ou la régulation négative des réactions secondaires concurrentes. Ce sont des domaines importants d'optimisation des processus réalisés grâce à la bio-ingénierie, mais l'optimisation globale des processus sera essentielle au-delà de la nécessité d'améliorer les usines de cellules microbiennes pour la production de gaz bioalcane.

La réduction sans précédent de l'activité économique mondiale et de la mobilité au début de 2020 en raison de la pandémie de Covid 19 a réduit la demande mondiale d'énergie de 3,8 % par rapport à la même période en 2019 [77]. Malgré cela, les approvisionnements en combustibles fossiles restent limités et non renouvelables, avec une demande toujours élevée. Le développement d'une bio-fabrication (en fin de compte) durable d'hydrocarbures gazeux arrive donc à point nommé, avec un succès mesuré par la capacité de rivaliser en termes de prix et d'abondance avec les voies de synthèse commerciales et non renouvelables existantes.


Matériaux et méthodes

Souches et médias

Milieu et conditions de croissance pour E. coli ont été précédemment décrits par Sambrook et Russell (2001) ceux pour Y. lipolytica ont été précédemment décrits par Barth et Gaillardin (1997). Un milieu riche (YPD) et un milieu de glucose minimal (YNB) ont été préparés comme décrit ailleurs (Milckova et al., 2004). L'YNB contenait 0,17 % (p/v) de base azotée de levure (sans acides aminés et sulfate d'ammonium, YNBww), 0,5 % (p/v) de NH4Cl, 50 mM KH2Bon de commande4-N / A2HPO4 (pH 6,8) et 2 % (p/v) de glucose. Pour compléter les auxotrophies de la souche, 0,1 g/L d'uracile ou de leucine a été ajouté si nécessaire. Pour dépister la résistance à l'hygromycine, 250 μg/ml d'hygromycine ont été ajoutés au YPD. Les milieux solides ont été préparés en ajoutant de la gélose à 1,5 % (p/v).

Construction de plasmides et de souches (E. coli et Y. lipolytica)

Nous avons utilisé des techniques de génétique moléculaire standard (Sambrook et Russell, 2001). Les enzymes de restriction ont été obtenues auprès de New England Biolabs (Ipswich, MA, USA). L'amplification par PCR a été réalisée dans un thermocycleur Eppendorf 2720 avec soit l'ADN polymérase haute fidélité Q5 (New England Biolabs) soit les ADN polymérases GoTaq (Progema, WI, USA). Les fragments PCR ont été purifiés à l'aide d'un kit de purification PCR (Macherey-Nagel, Duren, Allemagne), et les plasmides ont été purifiés avec un kit Plasmid Miniprep (Macherey-Nagel).

Les plasmides utilisés dans cette étude ont été construits en utilisant l'assemblage Golden Gate, comme décrit dans Celinska et al. (2017). Les gènes des modules A, T et H ont été obtenus par PCR en utilisant l'ADN génomique de Y. lipolytica W29. Les sites de reconnaissance Bsal internes ont été supprimés par PCR à l'aide des amorces répertoriées dans le tableau supplémentaire 1. Les plasmides pour chaque module comprenaient la séquence Zeta, le URA3 ex marqueur, et des cassettes d'expression génique contenant le TEF1 promoteur et LIP2 terminateur.

Pour le complexe PDH cytosolique, tous les gènes ont été synthétisés et clonés dans le plasmide pUC57 par GenScript Biotech (New Jersey, US). Cytosolique PDX1 a été cloné dans le plasmide d'expression (JME2563) en utilisant les sites de restriction BamHI et AvrII. Les quatre autres gènes ont été clonés dans deux plasmides (JME4774 et JME4775) en utilisant l'assemblage Golden Gate.

perturber PHD1, les cassettes ont été construites pour inclure un promoteur (pPHD1), un marqueur (URA3 ou LEU2), et un terminateur (TPHD1), qui a permis d'éliminer le gène ORF par recombinaison homologue, comme décrit dans Papanikolaou et al. (2013).

Des cassettes d'expression génique et de disruption ont été préparées par digestion NotI et transformées en Y. lipolytica souches par la méthode à l'acétate de lithium, comme décrit précédemment (Barth et Gaillardin, 1997). L'intégration et la rupture des gènes ont été vérifiées par PCR sur colonie à l'aide des amorces répertoriées dans le tableau supplémentaire 1. Le plasmide réplicatif hébergeant le Cré (JME547 Tableau 1) a été utilisé pour le sauvetage de marqueurs (Fickers et al., 2003). Après transformation avec le Cré plasmide d'expression, la perte du gène marqueur a été vérifiée sur YNB avec/sans uracile. La perte du plasmide réplicatif a été vérifiée en utilisant un placage de répliques sur YPD avec/sans hygromycine après culture sur YPD pendant 24 h. Pour construire la souche prototrophe, un LEU2 fragment du plasmide JMP2563 a été transformé. Toutes les souches et plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau 1.

Tableau 1. Les plasmides et souches utilisés dans cette étude.

Conditions de culture pour les expériences de biosynthèse des lipides

Les expériences de biosynthèse des lipides ont été réalisées dans des milieux minimaux, et les cultures ont été préparées comme suit : une pré-culture initiale a été établie en inoculant 10 mL de milieu YPD dans des erlenmeyers de 50 mL. Ensuite, la pré-culture a été incubée pendant une nuit à 28°C et 180 tr/min. La suspension cellulaire résultante a été lavée avec de l'eau distillée stérile et utilisée pour ensemencer 50 ml de milieu minimal YNBD6 contenant 0,17 % (p/v) de base azotée de levure (sans acides aminés et sulfate d'ammonium, YNBww, Difco), 0,15 % (p/v ) NH4Cl, 50 mM KH2Bon de commande4-N / A2HPO4 tampon (pH 6,8) et 6 % (p/v) de glucose. Ce milieu avait été placé dans des erlenmeyers de 250 mL. Les cultures ont ensuite été incubées à 28°C et 180 rpm.

Détermination des lipides

Les lipides ont été extraits de 10 à 20 mg de cellules lyophilisées et convertis en esters méthyliques d'AF (FAME) en utilisant la procédure décrite par Browse et al. (1986). Les FAME ont ensuite été analysés à l'aide de la chromatographie en phase gazeuse (GC), qui a été réalisée avec un instrument Varian 3900 équipé d'un détecteur à ionisation de flamme et d'une colonne Varian FactorFour vf-23ms, où la spécification de purge à 260ଌ est de 3 pA (30 m , 0,25 mm, 0,25 μm). Les FAME ont été identifiés via des comparaisons avec des standards commerciaux (FAME32, Supelco) et quantifiés en utilisant la méthode des standards internes, qui implique l'ajout de 100 μg d'acide dodécanoïque commercial (Sigma-Aldrich). Les AG à chaînes impaires du commerce (kit de chaînes droites de carbone impair contenant 9 AG, OC9, Supelco) ont été convertis en leurs FAME en utilisant la même méthode que celle utilisée avec les échantillons de levure. Ils ont ensuite été identifiés par GC et comparés aux AG à chaîne impaire des échantillons de levure.

Pour déterminer le poids des cellules sèches (DCW), 2 ml de la culture ont été prélevés des flacons, lavés et lysophilisés dans un tube pré-pesé. Les différences de masse correspondaient au mg de cellules retrouvées dans 2 mL de culture.


Résumé

Les Escherichia coli Le génome code pour sept paralogues de la superfamille des crotonases (enoyl CoA hydratase). Quatre d'entre eux ont des fonctions inconnues ou incertaines, leur existence était inconnue avant l'achèvement de la E. coli projet de séquençage du génome. Le gène codant pour l'un d'entre eux, YgfG, est situé dans un opéron à quatre gènes qui code pour des homologues de méthylmalonyl CoA mutases (Sbm) et d'acyl CoA transférases (YgfH) ainsi qu'une protéine kinase putative (YgfD/ArgK). Nous avons déterminé que YgfG est la méthylmalonyl CoA décarboxylase, YgfH est la propionyl CoA:succinate CoA transférase et Sbm est la méthylmalonyl CoA mutase. Ces réactions sont suffisantes pour former un cycle métabolique par lequel E. coli peut catalyser la décarboxylation du succinate en propionate, bien que le contexte métabolique de ce cycle soit inconnu. L'identification de YgfG en tant que méthylmalonyl CoA décarboxylase élargit la gamme de réactions catalysées par les membres de la superfamille des crotonases.

Cette recherche a été soutenue par l'Universität Karlsruhe, la Deutsche Forschungsgemeinschaft et le Fonds der Chemischen Industrie (à J.R.) et les subventions NIH GM-40570 et GM-52594 (à J.A.G.).

Adresser la correspondance à cet auteur. Téléphone : 217-333-3945. Télécopieur : 217-265-0385. Courriel : [e-mail protected]


Discussion

Several examples of unusual type I modular PKS extender units have been reported over the past half-decade. In all cases, these are assembled via a common final biosynthetic step, involving reductive carboxylation of an α, β-unsaturated CoA thioester by a CCRC homologue. The data reported here reveal an alternative mechanism for assembly of unusual type I modular PKS extender units. This employs a unique YCC β-subunit (MccB) that, in partnership with the primary metabolic YCC α-subunit, is able to directly carboxylate medium chain acyl-CoA thioesters. X-ray crystallographic analysis revealed the structural basis for substrate recognition by MccB, allowing a homologue likely involved in the biosynthesis of butylmalonyl-CoA and other unusual extender units incorporated into the primycin complex of clinically-used antibiotics to be identified.

These findings inspired the precursor-directed biosynthesis of novel azide- and alkyne-containing stambomycin analogues. Several biosynthetic engineering approaches have recently been utilized to introduce alkyne-terminated extender units containing 5–8 carbons into erythromycin and antimycin analogues 26,27,28 . Feeding of 8-nonynoic acid to S. ambofaciens resulted in the production of a stambomycin analogue containing a 9-carbon alkyne-terminated extender unit in comparable quantities to the natural products. Thus, MccB, the AT domain from module 12 of the stambomycin PKS and the medium chain acyl-CoA synthetase encoded by samR0482 are useful additions to the synthetic biology toolkit for bio-orthogonal tagging of polyketides.


Méthodes

Microbial strains and media

Table 1 lists the various strains and plasmids used in this study. Les E. coli LS5218 strain [fadR, atoC(Con)], which constitutively expresses the enzymes of fatty acid β-oxidation pathway, allows expression of various pathway genes cloned into pTrc99a and pBBR1MCS2 vectors upon induction with isopropyl-β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) [38]. The IPTG was added when the cells had reached an optical density at a wavelength of 600 nm (OD600) of 0.6. The PHA-producing strain LZ05 with deletion of the genes ptsG, tesB et yciA was described previously [23]. Les E. coli DH5α strain served as the host strain for subsequent construction and propagation of various PHA-producing plasmids. During the recombinant plasmid construction, strains were cultivated in Luria–Bertani (LB) medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl). For gene knockout, SOB medium (20 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 0.5 g/L NaCl, 10 mM MgCl2 and 2.5 mM KCl) was utilized.

Construction plasmidique

For the even-chain monomer supply, the construction of plasmid pQQ05 has been previously described [23]. Briefly, the genes yqeF, fadB, phaJ1Pa, ter et phaC2Pa were all cloned and ligated into the corresponding sites of pTrc99a which were cut with the same restriction enzymes stepwise to generate plasmid pQQ05.

The construction of odd-chain monomer generation pathway was as follows. The codon-optimized prpP gene was cloned into the pBBR1MCS2 vector between the Kpnmoi et BamHI sites to construct the plasmid of pZQ01. Later, in order to form the plasmid pBBR1MCS2-acs, namely pZQ02, the acs gene amplified via polymerase chain reaction (PCR) using E. coli MG1655 genomic DNA (gDNA) as template was also inserted into the pBBR1MCS2. Les prpE et pct fragments amplified from R. eutropha H16 gDNA with primers prpE-F/prpE-R and pct-F/pct-R were separately ligated into the pBBR1MCS2 to yield the plasmids pZQ03 and pZQ04. Subsequently, co-expression of two genes prpP et acs, prpP et prpE, prpP et pct in the pBBR1MCS2 was utilized to form the plasmids pZQ05, pZQ06 and pZQ07, respectively. All of the genes were under the control of the lac promoter with separated ribosomal binding site located upstream of each gene to facilitate the translation. Les R. eutropha H16 template used for these PCR reactions was isolated using the TIANamp Bacterial DNA Kit (TIANGEN BIOTECH, China). The primers used to amplify different fragments for cloning reactions are listed in Additional file 1: Table S1.

In all cases, PCR was performed using an S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA). PrimeSTAR HS DNA polymerase was purchased from Takara (Tokyo, Japan), restriction endonucleases were from Fermentas/Thermo Scientific (Pittsburgh, USA), and T4 DNA ligase was from New England Biolabs (Ipswich, USA). Propagated plasmids were prepared by TIANGEN Plasmid Mini Extraction Kit (TIANGEN BIOTECH, China), and restriction enzyme-digested products were purified using an E.Z.N.A.™ Gel Extraction Kit (Omega, USA). DNA sequencing of all constructed plasmids were performed by Liuhe BGI Tech Co. Ltd (Beijing, China). All of the constructed plasmids were transformed into the strain LZ05 and the optimum double plasmids were then transformed into the strain LZ08 according to standard procedures [39].

Gene knockout

Le gène pflB which encodes pyruvate formate lyase was knocked out by the one-step inactivation method as described previously [40] and variole B encoding pyruvate oxidase was knocked out by linearized DNA fragments with extending homologous sequence [41]. First, the linerized DNA fragments with the FLP recognition target sites and 39 bp homologous sequences were obtained via PCR using pKD4 (Km R ) as a template and pflB-F/pflB-R as primers. After the DNA gel extraction, the purified PCR product was electroporated into the host cells which carried the plasmid pKD46, and then E. coli LZ05 was induced by 0.3% (w/v) l -arabinose to express the λ Red system. The positive transformants were selected and identified by colony PCR using the primers pflB-test-F/pflB-test-R. Regarding the variole B deletion, primers poxB-F/poxB-R and chromosomal DNA of the strain QZ1111 were applied to amplify the linearized DNA fragments for variole B. The deletion procedure of variole B gene was as follows. After DpnI digestion, the PCR products were then purified and electroporated into the competent strain E. coli LZ05 containing the plasmid pKD46. Transformant cells were selected in solid LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, and 1.5% agar powder) containing chloramphenicol (Cm R ). Candidate clones were screened by PCR employing primers poxB-F/poxB-R. The PCR products were ultimately sequenced in Liuhe BGI Tech Co. Ltd (Beijing, China) if necessary. After removing pKD46, the corresponding Km R or Cm R cassette was removed with the helper plasmid pCP20. The plasmids pKD46 and pCP20 were eliminated by overnight cultivation at 42 °C. Finally, the strain LZ08 with the above two gene inactivation was generated.

Cultivation condition

The medium of shake flask study contains 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 30 mM NH4Cl, 5 mM (NH4)2DONC4, 1.48 mM Na2HPO4, and 100 μM FeSO4 supplemented with 125 mM MOPS.

For all shake flask experiments, single colony was inoculated into 5 mL LB broth and grown at 37 °C overnight. 0.5 mL pre-culture was inoculated to 300 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL LB and cultivated for 8 to 10 h and then 1% (v/v) seed inoculum for shake flask cultivation was incubated in 50 mL fermentation medium. When all liquid fermentation medium (50 mL) was incubated in 300 mL conical flasks at 37 °C with an agitation of 250 rpm to an optical density at 600 nm (OD600) of 0.6–0.8, 1 mM IPTG was added to the culture broth as an inducer. After induction, 30 g/L glucose was supplied as the sole carbon source at the appropriate time and then fermented for 72 h at 30 °C with shaking at 250 rpm. When necessary, ampicillin (100 μg/mL), kanamycin (50 μg/mL) or chloramphenicol (25 μg/mL) was added to the medium to maintain the stability of the plasmids. After cultivation, cells were gathered by centrifugation at 12,000 rpm for 15 min, washed with water twice and treated with ethanol once and then lyophilized.

PHA production analysis

The content and monomer compositions of intracellular accumulated PHA were analyzed by gas chromatography (GC) as described previously [42]. PHA content was defined as the percent ratio of PHA concentration to CDW. Liquid culture was centrifuged to obtain the supernatant and cellular biomass. 15 mg lyophilized cells were subjected to methanolysis in the presence of 1 mL of chloroform and 1 mL of 3% (v/v) sulfuric acid in methanol for 1 h at 100 °C. The samples were cooled to room temperature and then 1 mL of distilled water was added in order to extract the cell debris that is soluble in the aqueous phase. 10 mg/mL pentadecanoic acid in ethanol was added as an internal standard. The mixture was vortexed and centrifuged at 12,000 rpm for 10 min. After the layer separation, the organic (chloroform) phase (500 μL) was transferred to another new vial and analyzed using a Shimadzu GC2010 gas chromatograph (Kyoto, Japan) equipped with an AOC-20i auto-injector and a RestekRxi ® -5 column. PHA standard samples were dissolved in chloroform and also analyzed according to the method above by GC. The temperature program used was as follows: 80 °C hold for 1 min, ramp from 60 to 230 °C at 10 °C per min and a final hold at 230 °C for 10 min [23].

Cell growth, glucose consumption and acetate assimilation analyses

Cell growth was monitored by measuring OD600 utilizing a spectrophotometer (Shimazu, Japan). Glucose and acetate were quantitatively analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC) (Shimazu, Japan) which equipped with a refractive index detector (RID-10A) and an Ion Exclusion column (Bio-Rad, HPX-87H). The samples were first centrifuged at 12,000 rpm for 10 min, and then the supernatant was filtrated with a 0.22 μm filter membrane. 5 mM sulfuric acid was utilized as the mobile phase of HPLC with the flow rate of 0.6 mL/min and the utilized column temperature was 65 °C.

Analyses statistiques

All data examined were expressed as mean ± SD. Statistical analyses of the data were carried out using two-tailed Student’s t-test between two groups, and one-way ANOVA followed by the post hoc Tukey’s test for multiple groups. P < 0,05 a été considéré comme significatif. The * denotes P < 0.05, the *** denotes P < 0,001.



Commentaires:

  1. Kazragar

    Site intéressant

  2. Gabirel

    Je veux vous encourager à regarder Google.com

  3. Sim

    Une information intéressante. Merci!

  4. Gabbar

    Je pense que vous n'avez pas raison. je suis assuré. Discutons.

  5. Aethelmaere

    Réponse rapide :)

  6. Elek

    Je m'excuse, mais je pense que vous vous trompez. Écrivez-moi dans PM, nous parlerons.



Écrire un message